脊髓源性神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)脊髓損傷后功能恢復(fù)的意義.pdf

1、目的:脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)是目前的研究熱點(diǎn)，神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSCs)移植可有助于脊髓功能的恢復(fù)，但目前的研究多集中在紋狀體和皮層的神經(jīng)干細(xì)胞上，對(duì)脊髓源性神經(jīng)干細(xì)胞的研究為數(shù)不多。該實(shí)驗(yàn)對(duì)胚胎脊髓源性神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)、移植及對(duì)脊髓功能恢復(fù)的作用做了研究。 材料和方法:1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其分組：選擇中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部SD大鼠160只，體重200-250克，成年雌性。許可證號(hào)：SCXK(遼)2003

2、-0009，大鼠隨機(jī)分成4個(gè)組，40只為移植對(duì)象,40只為損傷對(duì)照組，40只為假手術(shù)組，40只為空白對(duì)照組。 2、脊髓損傷動(dòng)物模型的制備：120只大鼠用2％戊巴比妥鈉腹腔注射全麻后置于動(dòng)物固定架上，備皮，消毒，于T10-12水平行椎板切除術(shù)。做15-20mm的皮膚切口，向兩側(cè)分離背肌暴露下胸段T8-13棘突，咬除T10和T11間的椎板，暴露硬膜，用手術(shù)刀片于T11脊柱水平橫切此段脊髓，逐層縫合。動(dòng)物細(xì)心護(hù)理防止受傷。假手術(shù)組不損

3、傷脊髓，只行椎板切除，空白對(duì)照組不做任何處理。 3、神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)：在前期實(shí)驗(yàn)中，30只大鼠雌雄合籠后，檢查陰栓，記為E0d，至E10.5d，將動(dòng)物麻醉后，常規(guī)碘酒、酒精消毒皮膚，打開腹腔，暴露兩側(cè)子宮，用眼科鑷鉗住子宮頭端，順子宮分離至子宮角處剪下，放入培養(yǎng)皿中，依次去除子宮壁及胎膜，在解剖顯微鏡下仔細(xì)分離胎鼠脊髓中央管壁的室管膜細(xì)胞，再用D-Hanks液漂洗，用手術(shù)刀反復(fù)切割組織，再用200目細(xì)胞篩過濾，去除血管、結(jié)締

4、組織和組織塊，收集入小管中，再反復(fù)吹打，制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)細(xì)胞記數(shù)后，分裝入50ml培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞數(shù)約為1×106/ml，培養(yǎng)條件：6mlDMEM/F12+120ulB27+12ulbFGF，37℃，5％CO2，每6-7天傳代一次。傳至第5代，應(yīng)用nestin進(jìn)行干細(xì)胞鑒定。 4、細(xì)胞移植：術(shù)后第二天，大鼠再次麻醉，應(yīng)用5ul注射器連接無菌玻璃針頭，向脊髓損傷區(qū)共注射約5×104個(gè)細(xì)胞，用5分鐘注完。術(shù)后保持室溫在30℃左右，每

5、天進(jìn)行膀胱按摩，直到自主膀胱恢復(fù)，肌注慶大霉素1萬U/d，防止膀胱感染。損傷對(duì)照組和假手術(shù)組80只大鼠注射同等量的生理鹽水，術(shù)后處理措施同細(xì)胞移植組?？瞻讓?duì)照組不做處理。 5、行為學(xué)評(píng)價(jià)方法：實(shí)驗(yàn)大鼠在移植后1周、2周、4周后做斜板試驗(yàn)與Tarlov評(píng)分，斜板試驗(yàn)是讓動(dòng)物在一與地面成一定夾角的斜板上(動(dòng)物頭部向上)靜止5s，記下斜板度數(shù)。改良的Tarlov評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：測(cè)評(píng)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能狀況。0分：沒有自主性運(yùn)動(dòng)；1分：僅有髖膝關(guān)

6、節(jié)的非反射性運(yùn)動(dòng)；2分：有髖、膝、距小腿(踝)3個(gè)主要關(guān)節(jié)的運(yùn)動(dòng)；3分：能主動(dòng)支持體質(zhì)量和不協(xié)調(diào)步態(tài)，或偶爾出現(xiàn)協(xié)調(diào)步態(tài)；4分：前肢和后肢協(xié)調(diào)的步態(tài)，行走時(shí)有趾間關(guān)節(jié)的運(yùn)動(dòng)；5分：正常步態(tài)。 6、組織學(xué)觀察：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別在細(xì)胞移植后1天、3天、1周、2周、4周后過度麻醉并作4％多聚甲醛(PFA)心臟灌注。取出脊髓，4％PFA固定，作石蠟切片，行免疫組化染色，研究CD95和P75在移植前后的變化，Tunel方法觀察細(xì)胞凋亡的變化。

7、部分切片做HE染色，觀察組織結(jié)構(gòu)的改變。 7、電鏡觀察：動(dòng)物脊髓用50mlPBS和包含200ml8g/L的多聚甲醛及25g/L戊二醛的固定劑灌洗，隨后用四氧化鋨固定、脫水、包埋，醋酸鈾和枸櫞酸鋁染色，電子顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡的變化。 8、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：以上統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，P＜0.01，有顯著差異。 結(jié)果：1、HE染色結(jié)果：在空白對(duì)照組和假手術(shù)組，組織學(xué)研究表明是正常脊髓的特點(diǎn)。在損傷對(duì)照組，可見脊髓的萎

8、縮，有膠質(zhì)瘢痕和囊腔形成，在移植組，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的萎縮。 2、組織學(xué)結(jié)果：nestin染色顯示NSCs在移植動(dòng)物體內(nèi)存活良好，免疫組化顯示CD95和P75在細(xì)胞移植后表達(dá)明顯減少，與移植前比有顯著性差異。 3、TUNEL方法測(cè)定細(xì)胞凋亡結(jié)果空白對(duì)照組和假手術(shù)組的脊髓組織未發(fā)現(xiàn)明顯的TUNEL陽性細(xì)胞，脊髓損傷對(duì)照組可見TUNEL陽性細(xì)胞的表達(dá)，細(xì)胞移植組各時(shí)相點(diǎn)的陽性細(xì)胞數(shù)均少于損傷對(duì)照組，術(shù)后1天、3天、1周、2周、4

9、周五個(gè)時(shí)間點(diǎn)陽性細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01)。 4、電鏡結(jié)果：觀察發(fā)現(xiàn)損傷對(duì)照組的大鼠在橫切脊髓的部位有明顯的凋亡細(xì)胞，移植組細(xì)胞凋亡數(shù)與對(duì)照組比較明顯減少。5、行為學(xué)評(píng)價(jià)：移植術(shù)后斜板試驗(yàn)結(jié)果，第1周，損傷對(duì)照組18.5±0.76°，移植組38.3±0.84°，空白對(duì)照組和假手術(shù)組正常；第2周，損傷對(duì)照組19.7±0.66°，移植組39.4±0.78°，空白對(duì)照組和假手術(shù)組正常；第4周，損傷對(duì)照組22.3±0

10、.69°，移植組45.0±0.81°，空白對(duì)照組和假手術(shù)組正常。移植組和損傷對(duì)照組比較差異有顯著性，P=0.0022，P＜0.01。Tarlov評(píng)分結(jié)果，第1周，損傷對(duì)照組3.32±0.34，移植組4.37±0.45，空白對(duì)照組和假手術(shù)組正常；第2周，損傷對(duì)照組3.41±0.43，移植組4.45±0.38，空白對(duì)照組和假手術(shù)組正常；第4周，損傷對(duì)照組3.45±0.48，移植組4.63±0.47，空白對(duì)照組和假手術(shù)組正常。移植組和損傷對(duì)照

11、組比較差異有顯著性，P=0.0017，P＜0.01。 討論：長(zhǎng)期以來脊髓損傷的修復(fù)一直是一個(gè)醫(yī)學(xué)難題。神經(jīng)干細(xì)胞在修復(fù)受損神經(jīng)組織方面有良好的應(yīng)用前景，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或病變，特別是對(duì)脊髓損傷實(shí)施干細(xì)胞移植是新發(fā)展起來的治療策略。脊髓來自胚胎神經(jīng)管的尾部，原始神經(jīng)管腔發(fā)展為脊髓的中央管，管的周圍為脊髓的灰質(zhì)，內(nèi)含大量的神經(jīng)細(xì)胞團(tuán)，這些細(xì)胞團(tuán)主要有大、中、小型神經(jīng)元組成。位于脊髓前角的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元是脊髓最大的細(xì)胞，其樹突可長(zhǎng)達(dá)100

12、0um，發(fā)出的軸突(直徑9-13um)經(jīng)脊髓前根直至所支配骨骼肌的梭外肌。這與腦組織中神經(jīng)細(xì)胞的突起長(zhǎng)度有著顯著的差異。 在胚胎乃至成體的脊髓室管膜下都有神經(jīng)干細(xì)胞的存在，這種干細(xì)胞在發(fā)育期，可以通過自我復(fù)制來增殖，滿足發(fā)育期生成大量細(xì)胞的需要，同時(shí)部分子代細(xì)胞發(fā)生向神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的分化，滿足脊髓的功能需要；在成年期，這種細(xì)胞通常處于靜息狀態(tài)，只有在損傷后才受刺激活躍增生。Ogawa等從E14.5dSD大鼠胚胎分離出脊髓神經(jīng)干

13、細(xì)胞，在體外傳2-5代，見其植入頸髓損傷的大鼠模型，5周后免疫組化發(fā)現(xiàn)：神經(jīng)前體細(xì)胞分裂增殖，神經(jīng)元發(fā)出突起嵌入脊髓組織中，并與宿主神經(jīng)元形成突起結(jié)構(gòu)。在神經(jīng)干細(xì)胞中，脊髓源性相比腦源性神經(jīng)干細(xì)胞分化成的神經(jīng)細(xì)胞其突起的長(zhǎng)度顯著延長(zhǎng)，這與在體內(nèi)條件下脊髓的結(jié)構(gòu)和功能是相適應(yīng)的。本實(shí)驗(yàn)從孕10.5天大鼠胚胎脊髓分離培養(yǎng)的干細(xì)胞集落，經(jīng)反復(fù)傳代，仍呈Nestin免疫反應(yīng)陽性。在細(xì)胞移植后1周，移植組和對(duì)照組即有顯著性差異，說明脊髓功能得到部