骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞移植聯(lián)合GDNF治療脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、脊髓損傷是一種嚴(yán)重的傷病，其致殘率與致死率非常高。對(duì)于脊髓損傷的傳統(tǒng)治療方法有脊柱骨折脫位的復(fù)位固定、解除脊髓壓迫、對(duì)癥及康復(fù)治療。近年來(lái)，隨著神經(jīng)病理生理及神經(jīng)發(fā)育學(xué)研究的不斷深入，神經(jīng)組織細(xì)胞移植逐漸應(yīng)用于脊髓損傷的治療并取得了肯定的效果。神經(jīng)干細(xì)胞(Neuralstemcells，NSCs)特別是骨髓基質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)干細(xì)胞分化調(diào)控和移植修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能損害亦成為研究重點(diǎn)。 骨髓基質(zhì)細(xì)胞(Bonemarrowstroma

2、lcells，BMSCs)是骨髓細(xì)胞中除去造血干細(xì)胞之外的細(xì)胞部分，目前已證實(shí)骨髓基質(zhì)細(xì)胞在特定的培養(yǎng)條件下可分化成多種細(xì)胞，如間充質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等，具有克隆樣增殖特性。其多潛能性的發(fā)現(xiàn)和向神經(jīng)細(xì)胞方向定向分化的成功，為神經(jīng)干細(xì)胞的來(lái)源增加了一個(gè)新的途徑，也為解決“自體源神經(jīng)干細(xì)胞”移植方案中細(xì)胞數(shù)量不足的問(wèn)題提供了新的思路。 膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(

3、glialcellline-derivedneurotrophicfactor,GDNF)是一種新型的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，屬于TGF-p超家族成員，于1993年由Lin等首先從大鼠B49細(xì)胞系的上清中分離純化得到。GDNF是目前為止發(fā)現(xiàn)的在體外支持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生長(zhǎng)最有效的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子之一，不僅能挽救發(fā)育過(guò)程中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的程序性死亡，還可以促進(jìn)脊髓損傷后皮質(zhì)神經(jīng)元的存活。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，GDNF除了對(duì)中腦多巴胺能神經(jīng)元具有營(yíng)養(yǎng)保護(hù)作用外，還對(duì)感覺(jué)神經(jīng)

4、元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有不同程度的營(yíng)養(yǎng)保護(hù)作用。 本研究通過(guò)建立體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷仁侄?，?duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)干細(xì)胞(Bonemarrowstromalcells-derivedneuralstemcells，BMSCs-D-NSCs)的體外擴(kuò)增、定向分化、移植及其所移植細(xì)胞在損傷脊髓內(nèi)的存活情況等進(jìn)行研究，以進(jìn)一步了解BMSCs-D-NSCs的生物學(xué)特性，并探討其在脊髓損傷應(yīng)用的可行性和有效性。 第一部分 BMSCs體外誘導(dǎo)

5、分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究 目的： 研究SD大鼠BMSCs體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的可行性。 材料及方法： 1.以SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，無(wú)菌條件下獲取大鼠骨髓，梯度密度離心獲取BMSCs。 2.在體外應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基(專利號(hào)：ZL02134314.4)和細(xì)胞因子進(jìn)行BMSCs向神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。細(xì)胞培養(yǎng)中分別加入維甲酸(retinoicacid，RA)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神

6、經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Glialcellline-derivedneurotrophicfactor,GDNF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brainderivedneurotrophicfactor,BDNF)等細(xì)胞因子。 3.CK2型倒置相差光學(xué)顯微鏡(OLYMPAS，JAPAN)追蹤觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況并拍照；采用SABC法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。 結(jié)果： 1.大鼠BMSCs能在體外培養(yǎng)中增殖分化為神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞。培養(yǎng)

7、48小時(shí)后細(xì)胞有分裂現(xiàn)象，7d后可見(jiàn)細(xì)胞克隆團(tuán)。12d后大而圓細(xì)胞有出芽，16～21d細(xì)胞進(jìn)一步分化出長(zhǎng)突起，大多數(shù)長(zhǎng)突起細(xì)胞呈現(xiàn)出典型神經(jīng)元樣細(xì)胞，并交織成網(wǎng)。 2.經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，培養(yǎng)7～14d的神經(jīng)干細(xì)胞可特異性表達(dá)神經(jīng)巢蛋白(Nestin)；經(jīng)培養(yǎng)20d的神經(jīng)元樣細(xì)胞分別見(jiàn)成熟神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specificenolase，NSE)和神經(jīng)核蛋白(neuronspecificnuclearprote

8、in，NeuN)的表達(dá)。 結(jié)論： 大鼠BMSCs是具有較強(qiáng)的自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞，在一定條件下，可分化為神經(jīng)干細(xì)胞并進(jìn)一步分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，表達(dá)神經(jīng)組織細(xì)胞抗原。RA和GDNF在BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的過(guò)程中起著積極作用。BMSCs可作為神經(jīng)干細(xì)胞的種子細(xì)胞。 第二部分 BMSCs-D-NSCs移植兼用GDNF修復(fù)脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究 目的： 研究BMSCs-D-NSCs移植兼用

9、GDNF對(duì)損傷脊髓的修復(fù)作用。 材料及方法： 1.用半橫斷法制作脊髓損傷動(dòng)物模型； 2.將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為4組：A組：?jiǎn)渭兗顾钃p傷組；B組：脊髓損傷+GDNF組； C組：脊髓損傷+移植NSCs組；D組：脊髓損傷+移植NSCs十GDNF組； 另設(shè)假手術(shù)組以為正常對(duì)照。 3.以帶有綠色熒光蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs，進(jìn)行移植細(xì)胞的追蹤觀察； 4.手術(shù)后應(yīng)用行為學(xué)(BASso，Beattie，

10、andBresnahanlocomotorratingscale，BBB評(píng)分)、組織形態(tài)學(xué)觀察損傷脊髓功能恢復(fù)情況；應(yīng)用免疫組化染色方法觀察不同組別脊髓損傷處的膠質(zhì)原性纖維酸性蛋白(Glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)和凋亡的動(dòng)態(tài)變化情況； 5.熒光顯微鏡觀察移植細(xì)胞的存活狀況。 結(jié)果： 1.B組較A組脊髓損傷后GFAP表達(dá)降低、凋亡減少； 2.BMSCs-D-NSCs移植

11、可以在宿主脊髓中存活、發(fā)育、生長(zhǎng)、分化并形成神經(jīng)連接，促進(jìn)損傷脊髓功能恢復(fù)； 3.BBB評(píng)分顯示脊髓損傷功能恢復(fù)的水平：B、C、D組評(píng)分高于A組，B組和C組間無(wú)顯著差異；D組評(píng)分最高。 結(jié)論： GDNF能抑制脊髓損傷后反應(yīng)性星形膠質(zhì)化和細(xì)胞凋亡；骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞移植兼用神經(jīng)生長(zhǎng)因子能維持神經(jīng)元的細(xì)胞形態(tài)，對(duì)成年大鼠損傷脊髓功能恢復(fù)有促進(jìn)作用。NSCs移植與運(yùn)用外源性GDNF對(duì)于促進(jìn)成鼠損傷脊髓功能恢復(fù)具有協(xié)同效應(yīng)