HIF-1α基因及GDNF基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞移植治療大鼠脊髓損傷的研究.pdf

1、研究目的:
　　探討經(jīng)HIF-1α、GDNF基因修飾的神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)在大鼠脊髓內(nèi)移植后，神經(jīng)干細(xì)胞的存活和分化情況及其對(duì)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響。為脊髓損傷的基因治療提供新思路及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法:
　　采用電控大鼠脊髓損傷打擊裝置制作SD大鼠脊髓損傷模型95只，25g·c(2.5cm×10g)力致傷T13脊髓，隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照(Normal)5只，脊髓損傷組(SCI)30只，神經(jīng)干細(xì)胞移植組(NSC

2、)30只，HIF-1α、GDNF雙基因修飾的神經(jīng)干細(xì)胞移植組（HIF-1α、GDNF+NSC）30只，分別于移植后5個(gè)時(shí)相點(diǎn)（1周、2周、3周、5周、8周）對(duì)大鼠進(jìn)行BBB后肢功能評(píng)分和皮層體感誘發(fā)電位(corticalsomatosensory evoked potential，CSEP)檢查后，進(jìn)行灌注固定，取損傷段脊髓做石蠟切片，運(yùn)用HE染色、免疫組化、免疫雙標(biāo)檢測(cè)等方法，通過(guò)觀察移植處神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記物5-溴-2-脫氧尿苷（br

3、omodeoxy uridine/5-bromo-2-deoxy uridine，BrdU）的表達(dá)，觀察神經(jīng)絲-200(NF-200)的表達(dá)和觀察GFAP+BrdU、 NF-200+BrdU雙重染色的表達(dá)結(jié)果，分析HIF-1α、GDNF基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞的存活、分化情況，進(jìn)而分析HIF-1α、GDNF雙基因修飾的NSC對(duì)脊髓損傷的修復(fù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.H-E染色顯示，損傷組脊髓損傷后損傷區(qū)及中央管內(nèi)、灰質(zhì)中不同

4、程度出血，神經(jīng)元變性，脊髓前索、側(cè)索的軸索粗腫脹，壞死缺損區(qū)域形成;HIF-1α、GDNF雙基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞組移植治療后，出血、壞死等損傷性改變持續(xù)時(shí)間縮短，細(xì)胞殘留數(shù)目相對(duì)增多，尼氏體增加，形態(tài)大致正常的細(xì)胞數(shù)目較多，相同時(shí)間點(diǎn)與其它組相比較差異明顯。
　　2.BrdU免疫組化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞移植組在細(xì)胞移植處，均有BrdU染色陽(yáng)性細(xì)胞存在，表明移植細(xì)胞在宿主體內(nèi)可以存活，比較單純神經(jīng)干細(xì)胞移植組與HIF-1α、GDNF基因

5、修飾神經(jīng)干細(xì)胞移植組BrdU染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，基因修飾組明顯多于單純神經(jīng)干細(xì)胞組(P＜0.05)，雙基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞在宿主內(nèi)存活的數(shù)量增加;免疫雙標(biāo)檢測(cè)結(jié)果，在單純神經(jīng)干細(xì)胞移植組與HIF-1α、GDNF基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞移植組均有GFAP+BrdU和NF-200+BrdU雙染陽(yáng)性細(xì)胞;分析雙染陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占所有BrdU染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比例，移植后同一時(shí)間點(diǎn)，HIF-1α、GDNF雙基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞組神經(jīng)干細(xì)胞分化率高于單純神經(jīng)干細(xì)胞組

6、（P＜0.01）;NF-200染色，正常組脊髓白質(zhì)可見軸突陽(yáng)性著色，排列整齊密集，損傷組NF-200陽(yáng)性軸突灰度值降低;HIF-1α、GDNF基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞組與神經(jīng)干細(xì)胞組相比，移植后相同時(shí)間，NF-200灰度值均明顯增高，且前者高于后者差異明顯(P＜0.01)。
　　3.CSEP檢查結(jié)果:所有被檢測(cè)大鼠受傷前均獲得正常CSEP信號(hào)，包括1個(gè)負(fù)向波，潛伏期(17.1±0.5) ms，波幅（66.4±20.2）μV。受傷后各組動(dòng)

7、物CSEP信號(hào)均不同程度消失，潛伏期延長(zhǎng)，GDNF、HIF-1α基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞組從移植后第1周開始，大鼠CSEP信號(hào)開始出現(xiàn)恢復(fù)，但其波幅較傷前及正常組明顯下降，潛伏期也明顯延遲(P＜0.05)，與單純神經(jīng)干細(xì)胞組和損傷對(duì)照組CSEP潛伏期恢復(fù)有明顯差異(P＜0.01)。
　　4.所有手術(shù)組動(dòng)物BBB評(píng)分，移植后BBB評(píng)分逐漸升高，移植后同一時(shí)間點(diǎn)，NSC+GDNF、HIF-1α組評(píng)分高于SCI和NSC組，結(jié)果差異明顯(P＜0

8、.01)。
　　結(jié)論:
　　1.GDNF、HIF-1α基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞能在損傷脊髓內(nèi)可以存活。
　　2.GDNF、HIF-1α基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞能在損傷脊髓內(nèi)可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
　　3.GDNF、HIF-1α基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞移植較單純神經(jīng)干細(xì)胞移植可以增加干細(xì)胞的存活和分化。
　　4.GDNF、HIF-1α基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞移植能促進(jìn)脊髓損傷動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。
　　5.GDNF、H