GDNF基因修飾嗅鞘細(xì)胞移植聯(lián)合IN-1抗體修復(fù)急性脊髓損傷.pdf

1、研究背景: 脊髓損傷(Spinalcordinjury，SCI)一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最棘手的問題之一，其導(dǎo)致?lián)p傷平面以下的機(jī)體部分與大腦的聯(lián)系中斷，損傷平面以下感覺、運(yùn)動(dòng)、括約肌功能永久性障礙，目前仍無有效的治療方法。既往認(rèn)為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后其再生、修復(fù)和功能恢復(fù)是絕對(duì)不可能的。1981年神經(jīng)學(xué)家在基礎(chǔ)研究中證實(shí)中樞神經(jīng)損傷后的神經(jīng)結(jié)構(gòu)修復(fù)是可能的，掀起了各國(guó)學(xué)者對(duì)脊髓修復(fù)研究的又一次熱潮。SCI后軸突再生障礙的原因相當(dāng)復(fù)雜，其主

2、要原因有：(1)對(duì)脊髓的直接損傷及繼發(fā)炎癥使脊髓內(nèi)功能神經(jīng)元大量壞死或凋亡且神經(jīng)元再生困難；(2)脊髓損傷后暴露的髓鞘相關(guān)抑制分子、軸突生長(zhǎng)抑制性蛋白的大量分泌和釋放及繼發(fā)形成的膠質(zhì)瘢痕阻礙了軸突的生長(zhǎng)和正確連接；(3)損傷造成局部細(xì)胞凋亡，致使細(xì)胞分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子減少，破壞了神經(jīng)元修復(fù)和支持軸突再生的有利微環(huán)境。SCI修復(fù)機(jī)制十分復(fù)雜，SCI啟動(dòng)了各種有礙于脊髓再生的基因和調(diào)控基因，因而針對(duì)單一阻礙脊髓再生因素的干預(yù)往往作用有限。目

3、前SCI的修復(fù)研究主要集中在以下幾個(gè)方面：(1)藥物治療：如傳統(tǒng)的大劑量皮質(zhì)類固醇激素(甲基強(qiáng)的松龍)的沖擊治療，可以有效的減輕脊髓的繼發(fā)性炎癥損傷，保護(hù)并防止殘存的損傷神經(jīng)元進(jìn)一步凋亡。目前研究的氯化鋰(LiCl)、免疫抑制劑FK506等除了可以保護(hù)損傷神經(jīng)元外，還可以有效的促進(jìn)損傷軸突再生。(2)細(xì)胞移植：細(xì)胞移植是目前研究的熱點(diǎn)，其原理是利用某些種子細(xì)胞可以分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、黏附和趨化因子，營(yíng)養(yǎng)并保護(hù)損傷神經(jīng)元、誘導(dǎo)軸突再生及再髓

4、鞘化來修復(fù)SCI。既往的研究已為SCI修復(fù)提供了較成熟的種子細(xì)胞，如：胚胎干細(xì)胞(ESCs)、雪旺氏細(xì)胞(SCs)、嗅鞘細(xì)胞(OECs)、神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)、臍血干細(xì)胞(UCBCs)等，大量研究證實(shí)細(xì)胞移植均能夠在一定程度上促進(jìn)脊髓神經(jīng)功能的恢復(fù)。(3)組織移植：隨著組織工程學(xué)(tissueengineering)的飛速發(fā)展，一種更先進(jìn)的SCI修復(fù)理念逐步形成，即修復(fù)SCL必須包括組織水平上的重建，整

5、合SCI治療研究的各種有效策略，在誘導(dǎo)軸突定向再生的同時(shí)，減少局部膠質(zhì)瘢痕形成。目前，應(yīng)用于脊髓的組織工程支架主要有兩種，一種為人工合成可降解高分子生物材料，如：聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物等，另一種為自體或異體組織移植，如異體胚胎脊髓組織、自體肌纖維支架、游離周圍神經(jīng)(freeperipheralnerves,FPN)或帶血管蒂的游離周圍神經(jīng)(vascul-arizedperipheralnerve，VPN)組織移植修復(fù)脊髓損傷，也取得

6、了一定的修復(fù)效果。(4)改善脊髓損傷局部微環(huán)境：SCI后軸突再生困難的另一關(guān)鍵因素就是適宜軸突再生的微環(huán)境遭到破壞，各種不利于軸突再生的髓磷脂源性蛋白(myelin，MAG，Nogo-A，Omgp)軸突再生抑制分子大量分泌，而各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF、GDNF、NGF、NT3等)的缺乏及膠質(zhì)瘢痕形成阻礙了軸突再生。為此，抑制不利抑制因子(IN-1抗體)、提高有利營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF、GDNF等)，改善局部微環(huán)境成為目前研究重點(diǎn)。(5)聯(lián)

7、合治療：采取聯(lián)合不同作用機(jī)制的治療方法，更好的發(fā)揮協(xié)同作用來促進(jìn)SCI后神經(jīng)修復(fù)。如采用組織工程方法將種子細(xì)胞復(fù)合到人工合成高分子聚合材料或外周神經(jīng)組織制成的支架后移植，或利用基因工程方法將多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的基因片段轉(zhuǎn)染到種子細(xì)胞中，制成可分泌特定營(yíng)養(yǎng)因子的基因工程細(xì)胞來修復(fù)SCI均獲得了令人欣慰的研究成果。因此，本研究擬應(yīng)用GDNF基因修飾OECs移植和微泵局部定點(diǎn)持續(xù)給予軸突生長(zhǎng)抑制蛋白抗體IN-1來修復(fù)SCI，觀察該方法對(duì)SCI后

8、神經(jīng)再生和脊髓修復(fù)的影響，并探討其促進(jìn)脊髓修復(fù)的可能作用機(jī)制。 目的: 1.觀察嗅鞘細(xì)胞(OECs)與神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)共培養(yǎng)并誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞定向分化成神經(jīng)元的效果，為脊髓損傷后的細(xì)胞聯(lián)合移植提供理論依據(jù)。 2.探討在構(gòu)建大鼠脊髓全橫斷模型過程中，大鼠的性別對(duì)模型及脊髓損傷后后肢自發(fā)性功能恢復(fù)有無影響。 3.構(gòu)建攜帶有GDNF基因的慢病毒載體，并在體外觀察慢病毒載體是否可以有效的感染OECs及感染的OE

9、Cs是否能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)GDNF。 4.探討在體移植GDNF修飾的OECs聯(lián)合軸突生長(zhǎng)抑制蛋白抗體IN-1是否有良好的脊髓損傷修復(fù)作用。 方法: 1.分別從3月齡SD大鼠的嗅球和新生乳鼠的海馬中分離OECs及NSCs，進(jìn)行體外分離、培養(yǎng)及鑒定。純化后的OECs與NSCs共培養(yǎng)，誘導(dǎo)NSCs分化。 2.構(gòu)建大鼠胸髓(T10)全橫斷模型，觀察脊髓損傷后后肢自發(fā)性功能恢復(fù)的規(guī)律和特點(diǎn)，并比較性別差異對(duì)脊髓橫斷模

10、型及自發(fā)性功能恢復(fù)的影響。 3.采用基因克隆及分子生物學(xué)方法構(gòu)建帶有GDNF基因的減毒HIV慢病毒載體，并體外轉(zhuǎn)染嗅鞘細(xì)胞(OECs)，利用免疫印跡法(Westonblot)來判定轉(zhuǎn)染后的OECs是否可以長(zhǎng)期穩(wěn)定的表達(dá)GDNF。 4.50只成年雌性SD大鼠，制備中胸髓全橫斷傷模型，應(yīng)用滲透壓微泵在脊髓損傷局部蛛網(wǎng)膜下腔連續(xù)給入IN-1，同時(shí)脊髓損傷局部移植GDNF修飾的OECs。通過免疫組化染色的方法，觀察損傷局部神經(jīng)元

11、的殘留及神經(jīng)纖維的表達(dá)和分布；通過皮質(zhì)脊髓束和脊髓順(逆)行追蹤，觀察皮質(zhì)脊髓束和脊髓神經(jīng)纖維的再生與分布；通過BBB評(píng)分明確后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的程度，并以此來評(píng)價(jià)治療措施對(duì)脊髓損傷修復(fù)效果。 結(jié)果: 1.體外培養(yǎng)、純化OECs的純度可達(dá)到93％，NSCs自然分化為神經(jīng)元的分化率約為4％，純化后的OECs與NSCs共培養(yǎng)，誘導(dǎo)NSCs分化為神經(jīng)元的分化率約為23％。 2.胸髓T10全橫斷的雌、雄大鼠在術(shù)后死亡率及后

12、肢自發(fā)性功能恢復(fù)BBB評(píng)分上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所有動(dòng)物的后肢運(yùn)動(dòng)BBB評(píng)分在各個(gè)時(shí)間的評(píng)分都非常接近，在術(shù)后4周達(dá)到了7～8分左右，并且在以后的時(shí)間里維持在8分的水平不再增加。但術(shù)后泌尿系統(tǒng)的并發(fā)癥，雌性大鼠明顯少于雄性大鼠，且易于術(shù)后護(hù)理。 3.帶有GDNF基因的減毒HIV慢病毒載體在體外可以有效的轉(zhuǎn)染嗅鞘細(xì)胞(OECs)，轉(zhuǎn)染率可達(dá)67％，轉(zhuǎn)染后的OECs長(zhǎng)期存活，并穩(wěn)定表達(dá)GDNF。 4.術(shù)后8周可觀察到Hoechet

13、標(biāo)記的嗅鞘細(xì)胞在體內(nèi)存活并在脊髓內(nèi)遷移。FITC熒光標(biāo)記NF-200陽性的神經(jīng)纖維，在IN-1組和對(duì)照組可見脊髓殘端萎縮，未見軸突再生；GDNF-OECs組和OECs組可見脊髓損傷區(qū)雜亂無序的再生軸突，但無連續(xù)性神經(jīng)纖維通過損傷區(qū)；GDNF-OECs+IN-1組可見大量再生軸突，有連續(xù)性神經(jīng)纖維通過損傷區(qū)。熒光金逆行脊髓追蹤顯示GDNF-OECs+IN-1組在大腦皮質(zhì)中有少量被熒光金標(biāo)記的神經(jīng)錐體細(xì)胞，而GDNF-OECs組偶見被熒光金

14、標(biāo)記的神經(jīng)錐體細(xì)胞，其余三組在大腦皮之中未見被熒光金標(biāo)記的神經(jīng)錐體細(xì)胞。后肢功能運(yùn)動(dòng)BBB評(píng)分除對(duì)照組和IN-1組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，各組間均有顯著性差異。 結(jié)論: 1.嗅鞘細(xì)胞可以有效的誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化。 2.脊髓橫斷大鼠的自發(fā)性后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)可達(dá)到并維持在BBB評(píng)分8分的水平，大鼠術(shù)后死亡率及自發(fā)性后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)BBB得分與性別無關(guān)，因術(shù)后護(hù)理上雌性大鼠優(yōu)于雄性大鼠，故建議應(yīng)用雌性大鼠構(gòu)建脊懿