嗅鞘細(xì)胞移植修復(fù)大鼠脊髓半橫斷損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探索一種簡便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的獲得大鼠嗅鞘細(xì)胞(olfactoryensheathing cells，OECs)的方法；觀察OECs對脊髓半橫斷損傷(hemisection of spinal cord injury,，hSCI)大鼠的后肢運(yùn)動功能、后肢小腿三頭肌橫截面積和直徑的影響；檢測Sema3A、NP-1、Vcxsican在脊髓腹角中的表達(dá)，初步探討OECs修復(fù)損傷脊髓的機(jī)制。 方法： 取2.5月齡雌性SD大鼠嗅球

2、最外二層，經(jīng)胰蛋白酶消化和機(jī)械吹打分散成單細(xì)胞懸液，以1×10<'6>/mL 密度種植于含20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)的第12h和24h分別進(jìn)行兩次差速貼壁處理，第7d加入5×10<'-5>mol/L的阿糖胞苷作用36h左右以除去成纖維細(xì)胞，定期進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并攝片。第14d用ABC法進(jìn)行膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和神經(jīng)生長因子受體(nerve gr

3、owth factor receptor p75，NGFRp75)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，并計(jì)算OECs的純度；分別收集培養(yǎng)上清液和細(xì)胞(密度為1×10<'7>/mL)備用。 35只雌性成年SD大鼠，5只不做任何處理為正常組，另外30只隨機(jī)分成A、B、C、D、E組，制成脊髓左側(cè)半橫斷損傷模型后隨即分別移植純化的OECs懸液、純化的OECs培養(yǎng)上清液、未純化的OECs懸液、未純化的OECs培養(yǎng)上清液、DMEM/F12培養(yǎng)液，術(shù)后第1d、3

4、d、5d、1w、2w、3w、4w、5w、6w分別進(jìn)行BBB評分和IP試驗(yàn)。 術(shù)后第6w，4％多聚甲醛灌注固定所有大鼠，取左側(cè)后肢小腿三頭肌及T<,11>～T<,12>脊髓節(jié)段。 肌組織經(jīng)常規(guī)石蠟包埋、切片(片厚5μm)、HE染色，采用Image-pro plus5.0.2圖象分析軟件測量各組肌細(xì)胞橫截面積和直徑。 脊髓標(biāo)本冰凍橫切片，片厚30gm，用ABC法分別進(jìn)行Sema3A(1:1600)、NP-1(1:40

5、0)和Versican(1:1200)免疫組化染色，同時(shí)設(shè)立空白對照組及置換實(shí)驗(yàn)組；光鏡下觀察并計(jì)數(shù)腹角免疫組化反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)，采用同上軟件測量各組脊髓腹角Sema3A、NP-1及Versican免疫組化反應(yīng)陽性反應(yīng)物的平均光密度值(正常組取任意側(cè)，各手術(shù)組均取左側(cè))。 結(jié)果用單因素方差分析及SNK法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，凡P<0.05，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 培養(yǎng)的OECs呈雙極、多極、扁圓形三種，以雙極和多極

6、細(xì)胞為主。GFAP反應(yīng)陽性細(xì)胞胞質(zhì)和突起黃染，胞核無染呈空泡狀；NGFRp75染色為胞質(zhì)和突起淡染，胞核深染。GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性細(xì)胞率為91％，NGFRp75免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性細(xì)胞率為90％，表明獲得了高純度的OECs。 各組BBB評分在術(shù)后第1d均為0，后漸增高，第2w時(shí)可達(dá)到6分左右。3w后A組評分明顯較其它手術(shù)組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各組的IP試驗(yàn)在術(shù)后第1d從術(shù)前的85°降至12.5°左右，隨

7、著時(shí)間的推移逐漸升高。4w后A組明顯較其它手術(shù)組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明純化的OECs移植組大鼠后肢運(yùn)動功能的恢復(fù)最好。各手術(shù)移植組在術(shù)后第6w左側(cè)后肢小腿三頭肌纖維橫截面積及直徑均較正常組減少，E組減少最多，A組減少幅度明顯較其它手術(shù)組小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明純化的OECs移植組大鼠后肢小腿三頭肌萎縮程度最輕。 Sema3A、NP-1、Versican在各組脊髓腹角運(yùn)動神經(jīng)元均有表達(dá)，免疫組

8、化反應(yīng)陽性產(chǎn)物定位于胞漿，各手術(shù)組免疫組化反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)及平均光密度值均較正常組增加，E組最高，A組增幅明顯較其它手術(shù)組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明純化的OECs移植組在該三者的表達(dá)下調(diào)較其它手術(shù)組明顯。 結(jié)論： 1．差速貼壁和阿糖胞苷化學(xué)抑制相結(jié)合進(jìn)行成年大鼠OECs原代培養(yǎng)是一種簡便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的方法，可獲得高純度的OECs。 2．OECs移植能明顯促進(jìn)hSCI大鼠后肢運(yùn)動功能恢復(fù)。 3