ChABC、GDNF、Nogo-A抗體聯(lián)合應(yīng)用促損傷脊髓再生修復(fù)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：1.體外評(píng)價(jià)確定Nogo-A抗體是否能中和抑制性抗原的抑制作用2.探討ChABC、GDNF及Nogo-A抗體聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠脊髓完全性橫斷傷后脊髓再生修復(fù)及功能恢復(fù)的影響。 方法：1.3T3成纖維細(xì)胞擴(kuò)展評(píng)價(jià)：成纖維細(xì)胞擴(kuò)展在CNS髓磷脂或富含Nogo-A的蛋白提取液包被的培養(yǎng)皿中被強(qiáng)烈抑制。當(dāng)用能與該抗原結(jié)合并中和其抑制活性的抗體后，3T3細(xì)胞的擴(kuò)展得到較大程度的恢復(fù)。 2.采用大鼠胸段(T7-8)脊髓完全橫切

2、損傷模型，將SD大鼠隨機(jī)分為10組：正常組(n=6)、假手術(shù)組(n=6)、單純橫斷組(n=10)、A(ChABCn=10)組、G(GDNFn=10)組、N(Nogo-A抗體n=10)組、AG(ChABC+GDNFn=10)組、AN(ChABC+Nogo-A抗體n=10)組、GN(GDNF+Nogo-A抗體n=10)組、AGN(ChABC+GDNF+Nogo-A抗體n=10)組。正常組：不進(jìn)行任何干預(yù)處理；假手術(shù)組：只咬除T7-8椎板，不

3、損傷硬脊膜，在橫斷節(jié)段下方咬除T10的單側(cè)椎板。蛛網(wǎng)膜下腔放置PE-10導(dǎo)管，術(shù)后生理鹽水10μl/d，連續(xù)10天；單純橫斷組：脊髓橫斷后，生理鹽水10μl/d，連續(xù)10天；A組：ChABC：6μl/次，隔日一次，共5次；G組：GDNF：4μl/次，每日一次，共10次：N組：Nogo-A抗體：25μl/次，每日一次，共10次；A+G組：ChABC：6μl/次，隔日一次，共5次，GDNF：4μl/次，每日一次，共10次；A+N組：ChAB

4、C：6μl/次，隔日一次，共5次，Nogo-A抗體：25μl/次，共10次；G+N組：GDNF：4μl/次，每日一次，共10次，Nogo-A抗體：25μl/次，共10次；A+G+N組：ChABC：6μl/次，隔日一次，共5次，GDNF：4μl/次，每日一次，共10次，Nogo-A抗體：25μl/次，共10次；于大鼠脊髓損傷術(shù)后1W、2W、3W、4W、5W、6W、7W、8W、12W、14W、16W、18W、20W、24W進(jìn)行行為學(xué)評(píng)估。2

5、4W時(shí)取材，每組任選3只于取材前兩周行BDA順行示蹤處理，余者取材前行電生理檢測。所取脊髓標(biāo)本作NF-200、GAP-43、GFAP免疫組化檢查，并采用免疫組化圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。 結(jié)果：1.行為學(xué)評(píng)分：損傷后3W內(nèi)，評(píng)分均在8分左右，然后各治療組評(píng)分開始有較明顯增高，14-16周評(píng)分達(dá)高峰，然后開始呈下降趨勢。正常大鼠行為學(xué)評(píng)分為53.5分，假手術(shù)組術(shù)后2w，評(píng)分與正常組無差異；4W以后，各治療組行為學(xué)評(píng)分好于單純橫斷組

6、(p＜0.05)，各治療組中，AGN組的評(píng)分優(yōu)于其它治療組(p＜0.05)；A組的評(píng)分高于G組和GN組但弱于AG組(p＜0.05)，治療組中G組的評(píng)分最低(p＜0.05)；AN組高于GN組(p＜0.05)。單純橫斷組最高評(píng)分11.0±1.47，A組30.0±4.55，G組26.1±3.72，N組27.4±2.31，AG組27.6±3.14，AN組28.6±1.95，GN組25.6±2.59，AGN組33.8±1.77。 2.大腦

7、皮層誘發(fā)電位：術(shù)后24W，所有脊髓橫斷組中，僅AGN組記錄到潛伏期延長的SEP，余均未記錄到SEP波形； 3.脊髓標(biāo)本大體觀察：單純脊髓橫斷組脊髓橫斷處及鄰近兩端瘢痕較長，遠(yuǎn)段脊髓變細(xì)，各實(shí)驗(yàn)組瘢痕長度較短，遠(yuǎn)段脊髓變細(xì)不明顯。 4.BDA示蹤：AGN組可見BDA染色的藍(lán)色顆粒由損傷區(qū)近段經(jīng)損傷區(qū)達(dá)傷區(qū)遠(yuǎn)段，藍(lán)染的再生神經(jīng)纖維稀少，其它脊髓橫斷的各組傷區(qū)及遠(yuǎn)段未見藍(lán)染的神經(jīng)纖維；白質(zhì)內(nèi)見彌散分布的小囊腔，損傷區(qū)可見大的囊

8、腔，損傷區(qū)近側(cè)段變性較局限，遠(yuǎn)側(cè)段廣泛變性；各治療組空泡樣變較單純橫斷組輕。。5.免疫組化結(jié)果：各組均可見損傷區(qū)及其遠(yuǎn)近端由強(qiáng)弱不等的NF陽性表達(dá)。單純橫斷組在損傷區(qū)近側(cè)由中度表達(dá)，傷區(qū)及遠(yuǎn)側(cè)為弱陽性或陰性表達(dá)；各治療組損傷區(qū)及遠(yuǎn)近端的均有陽性表達(dá)。 6.圖像分析示：A、AG、AN、AGN組陽性染色面積多于單純橫斷組(p＜0.05)；AGN組(262.3±151.60)與G、N、GN各組之間由統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；G、N、

9、AG、AN、GN治療組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。G、N、GN組與單純橫斷組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。GAP-43染色結(jié)果：A、AG、AN、AGN治療組6m時(shí)GAP-43染色強(qiáng)度高于單純橫斷組(p＜0.05)；各治療組中，AGN組(219.5±92.41)染色強(qiáng)度最高(p＜0.05)，GN組陽性表達(dá)弱于A、AG、AN組(p＜0.05)，G、N組弱于AG、AN組(p＜0.05)，A組的陽性表達(dá)強(qiáng)于G、N組(p＜0.05)。GF

10、AP免疫組化染色：單純橫斷組陽性表達(dá)明顯高于各治療組(p＜0.05)，而各治療組之間GFAP陽性表達(dá)的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。 結(jié)論：1.3T3成纖維細(xì)胞擴(kuò)展評(píng)價(jià)，抗Nogo-A抗體能與髓磷脂中抑制性抗原結(jié)合，中和抑制性因子的作用。 2.ChABC、GDNF、抗Nogo-A抗體單獨(dú)或兩兩聯(lián)合應(yīng)用，能改善脊髓損傷區(qū)及兩段的神經(jīng)細(xì)胞功能，促進(jìn)軸突再生， 3.ChABC、GDNF、抗Nogo-A抗體聯(lián)合應(yīng)用能