Nogo受體拮抗劑與甲基強的松龍聯合治療對脊髓損傷修復的影響.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開：
　　 第一部分大鼠急性脊髓損傷動物模型的建立及脊髓組織病理的觀察
　　 目的：建立大鼠脊髓背側半橫斷模型，觀察性別差異對脊髓損傷(Spinalcord injury,SCI)后肢自發(fā)性功能恢復及脊髓組織病理變化的影響。方法：健康Wistar大鼠40只按性別隨機分兩組，構建大鼠胸髓(T9)背側半橫斷模型，觀察后肢自發(fā)性功能恢復的規(guī)律和特點。術后12h、ld、3d、7d處死動物，取出脊髓組織，用

2、HE染色法觀察脊髓的一般組織病理學變化。結果：大鼠胸髓背側半橫斷后，損傷脊髓有明顯出血、水腫、變性、空泡等，雌、雄大鼠后肢自發(fā)性功能恢復BBB評分上無統(tǒng)計學差異，所有動物的后肢運動BBB評分在各個時間的評分都非常接近，在術后4周達到了8分左右，并且在以后的時間里維持在8分的水平不再增加。但術后死亡率、泌尿系統(tǒng)的并發(fā)癥，雌性大鼠明顯少于雄性大鼠，且易于術后護理。結論：結合脊髓的一般組織病理學變化規(guī)律，SCI動物模型建立成功，可應用于SCI

3、的實驗研究。大鼠術后自發(fā)性后肢運動功能恢復與性別無關，因術后雌性大鼠護理上優(yōu)于雄性大鼠，故建議應用雌性大鼠構建SCI模型。
　　 第二部分Nogo受體(NgR)在大鼠脊髓組織中的表達及意義
　　 目的：探討SCI后髓鞘相關抑制分子Nogo受體NgRmRNA和蛋白表達的變化規(guī)律及意義，并探討Nogo受體拮抗劑(NEPl-40)應用于SCI動物模型中的療效。方法：健康Wistar大鼠108只隨機分為假手術組、創(chuàng)傷對照組、NE

4、Pl-40治療組，建立大鼠胸髓(T9)背側半橫斷模型。NEPl-40的給藥方法為術后于硬膜下管給予NEPl-4012.5 ug/(20ul/PBS.d)，連續(xù)28d，對照組給予等量生理鹽水。術后24h、3d、7d、14d、28d、42d處死動物，取出脊髓組織，逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)的方法檢測NgRmRNA，免疫熒光及Western Blot的方法檢測NgR蛋白表達，觀察各組SCI后NgR的變化。結果：假手術組NgR mRN

5、A及蛋白表達在各個時間點無顯著變化（P>0.05）。SCI脊髓組織中NgR mRNA表達量在損傷后24h表達減少，3d后上升，7d后逐漸上升至正常水平（與假手術組比較，P>0.05）；至14d達到高峰并維持于較高水平，至傷后28d緩慢下降（與假手術組比較，P<0.05）；傷后42d恢復至傷前水平。SCI脊髓組織中NgR蛋白表達量在損傷后24h表達減少，3d后再次下降，7d后逐漸上升至正常水平(與假手術組比較，P>0.05);至第14天達

6、到高峰并維持于較高水平，至傷后28d緩慢下降（與假手術組比較，P<0.05）；傷后42d恢復至傷前水平。SCI后14d、28d，NEPl-40組NgRmRNA及蛋白較創(chuàng)傷組均明顯減少P<0.05）。結論：SCI后NgR表達呈現動態(tài)變化規(guī)律，針對NgR進行干預有望為SCI后的治療找到新的靶點，NEPl-40在神經再生過程中可能發(fā)揮著重要作用。
　　 第三部分甲基強的松龍對大鼠脊髓損傷后細胞凋亡及TNF-α表達的影響
　　

7、目的：觀察大劑量甲基強的松龍(methylprednisolone，MP)治療對大鼠受損脊髓腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、神經細胞凋亡及凋亡基因表達的影響。方法：健康雌性Wistar大鼠124只，隨機分為假手術組、創(chuàng)傷對照組、MP治療組。建立大鼠胸髓(T9)背側半橫斷模型。MP的給藥方法為術后30 min內經鼠尾靜脈給予MP30mg/kg；對照組給予等量生理鹽水。術后lh、4h、12h、24h、3d、7d處死動物，取出脊髓組織，TUN

8、EL檢測細胞凋亡，轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)的方法檢測mRNA，免疫組織化學及Western Blot的方法檢測蛋白表達，觀察各組SCI后Bcl-2、Bax和TNF-α的變化。結果：采用TUNEL法檢測細胞凋亡，結果SC124h時，脊髓組織細胞凋亡達高峰，然后逐漸下降，與假手術組比較，差異顯著(P<0.05），給予MP治療后，凋亡率明顯降低，與創(chuàng)傷對照組比較，差異具有顯著性(P<0.05）。Bcl-2、Bax mRNA及蛋白結果

9、顯示，在SCI后4h、12h、3d、7d時MP組大鼠Bcl-2/Bax比值高于創(chuàng)傷組P>0.05），在SCI后24h，MP治療組大鼠脊髓組織Bcl-2/Bax比值明顯高于創(chuàng)傷組（P<0.01）。TNF-α mRNA及蛋白結果顯示在SCI第12h時，SCI組大鼠脊髓組織TNF-α表達即達峰值，與假手術組比較，差異具有顯著性(P<0.05）；隨著損傷時間的延長，TNF-α表達逐漸降低，至SCI后14d時，趨于正常水平。應用MP治療后，治療組

10、大鼠TNF-α表達水平明顯降低，與創(chuàng)傷對照組比較，差異具有顯著性（P<0.05）。結論：細胞凋亡是SCI早期主要的生物學事件；細胞凋亡的調控基因家族Bax/Bcl-2通過調節(jié)細胞凋亡參與SCI的發(fā)生發(fā)展；MP可抑制大鼠SCI細胞的凋亡，并可調節(jié)TNF-α等炎癥相關因子含量，從而實現對SCI的影響。
　　 第四部分Nogo受體拮抗劑與甲基強的松龍聯合治療促進大鼠脊髓損傷后軸突再生和功能恢復
　　 目的：探討NEPl-40與

11、MP聯合治療對大鼠胸髓背側半橫斷傷后脊髓再生修復的影響及可能機制。方法：健康雌性Wistar大鼠108只，隨機分為創(chuàng)傷對照組、MP治療組、NEPl-40治療組和聯合治療組。建立大鼠胸髓(T9)背側半橫斷模型。MP的給藥方法為術后30 min內經鼠尾靜脈給予MP30 mg/kg; NEPl-40的給藥方法為術后于硬膜下管給予NEPl-4012.5 ug/(20μl/PBS·d)，連續(xù)7d;對照組給予等量生理鹽水。在不同時間點，免疫熒光、逆

12、轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)、Western Blot的方法檢測GAP-43、MBP mRNA; GAP-43、MBP、GFAP蛋白的表達，分別采用BBB運動學功能評分、生物素葡聚糖胺(BDA)順行示蹤、透射電鏡觀察等方法，觀察動物的運動功能、脊髓再生的軸突和髓鞘。結果：SCI后14d、28d，聯合用藥組較其他各組GAP-43、MBP mRNA及蛋白的表達明顯增加(P<。05），同時星形膠質細胞(GFAP)活化數目和活化持續(xù)時間明

13、顯減少(P<0.05）。超微結構顯示聯合用藥組軸突數量多于單獨用藥組，且髓鞘的完整性強于單獨用藥組。用藥組SCI區(qū)及其遠端BDA標記的神經纖維數量明顯多于創(chuàng)傷對照組，聯合治療組最多（P<0.05）。BBB行為學評分顯示MP組的行為學評分提高在SCI兩周內明顯，而NEPl-40組行為學評分提高在SCI兩周后明顯，相對于單獨用藥干預組，聯合用藥產生更好的功能恢復與軸突再生(P<0.05）。結論：本實驗證實MP和NEPl-40聯合使用后其作用