ATRA干預(yù)培養(yǎng)鼠胚神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合GDNF移植對(duì)脊髓損傷再生修復(fù)的作用.pdf

1、目的:研究體外應(yīng)用1.0μmol/L全反式維甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）進(jìn)行干預(yù)，培養(yǎng)鼠胚神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)，聯(lián)合膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cell line derived neurotrophic factor, GDNF）移植至脊髓全橫斷損傷模型大鼠的損傷脊髓，探索該方法對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)再生和修復(fù)的作用。
　　方法:(1)取孕2周SD大鼠

2、胚胎額頁(yè)皮層組織，置于含神經(jīng)生長(zhǎng)因子(20ng/ml bFGF，20ng/ml EGF)的無(wú)血清培養(yǎng)液內(nèi)懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞接種密度為1×106/ml，5～7天傳代;取傳三代的NSCs，在含1.0μmol/LATRA的培養(yǎng)液中誘導(dǎo)培養(yǎng)7天，用免疫熒光染色法鑒定神經(jīng)干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物Nestin及NSE、GFAP抗體的表達(dá)。選取高密度增殖的NSCs用BrdU進(jìn)行標(biāo)記，以備移植。(2)將60只雌性SD大鼠(200～250g)用2％戊巴比妥鈉(

3、30mg/kg)腹腔注射麻醉，制備胸段(T9-T11)脊髓全橫斷損傷模型。大鼠隨機(jī)分為6組:正常組(n=10)、假手術(shù)組(n=10)、損傷對(duì)照組(n=10)、ATRA干預(yù)組(n=10)、GDNF組(n=10)、ATRA+GDNF組(n=10)。假手術(shù)組僅行椎板切除，不做其他干預(yù);損傷對(duì)照組行脊髓橫斷，使用微量注射器注入生理鹽水(15μl/天，連續(xù)7天);ATRA干預(yù)組脊髓橫斷后，使用微量注射器注入10μl含有2×105/μlBrdU標(biāo)記

4、的NSCs; GDNF組脊髓橫斷后，通過(guò)蛛網(wǎng)膜下腔導(dǎo)管注入GDNF(15μl/天，連續(xù)7天);ATRA+GDNF組脊髓橫斷后，通過(guò)蛛網(wǎng)膜下腔導(dǎo)管同時(shí)注入NSCs和GNDF(NSCs10μl，GDNF15μl，共25μl/天，連續(xù)7天)。每組大鼠于移植前1d、移植后1、2、5、8周進(jìn)行行為學(xué)評(píng)估大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的變化，實(shí)施電生理檢查及篩網(wǎng)走道實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)大鼠感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況;于移植后2、5、8周進(jìn)行心臟灌注，分別取損傷段、造模段和

5、移植段脊髓組織作蘇木素-依紅（HE）染色，作組織學(xué)觀察及5-溴脫氧尿嘧啶核苷/膠質(zhì)纖維酸性蛋白(BrdU/GFAP)和微管相關(guān)蛋白-2/膠質(zhì)纖維酸性蛋白（MAP-2/GFAP）免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)并追蹤標(biāo)記移植細(xì)胞的分化與分布，檢測(cè)神經(jīng)纖維再生情況。使用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:(1)體外應(yīng)用1.0μmol/LATRA進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)的NSCs呈Nestin陽(yáng)性及NSE、GFA

6、P抗體陽(yáng)性，細(xì)胞增殖顯著，細(xì)胞分化為神經(jīng)元的比例增多。(2)行為學(xué)評(píng)估顯示:移植后2周開(kāi)始，ATRA+GNDF組評(píng)分高于ATRA干預(yù)組和GNDF組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，從5周開(kāi)始，各組評(píng)分無(wú)明顯變化，8周時(shí)以ATRA+GDNF組評(píng)分最高(P＜0.01)。(3)篩網(wǎng)走道觀察結(jié)果顯示:移植前除正常組和假手術(shù)組外，其余各組大鼠雙下肢完全癱瘓，走篩網(wǎng)時(shí)雙下肢無(wú)力，只能靠身體前肢拖行，后肢偶爾微動(dòng)，極易踩空，移植后第8周，ATRA+

7、GNDF組前后肢出現(xiàn)步態(tài)協(xié)調(diào)，腳掌可負(fù)重，但無(wú)法支撐軀體。(4)電生理檢查結(jié)果顯示:移植后2周、5周、8周SEP及MEP波形逐漸恢復(fù)，潛伏期逐漸縮短，ATRA干預(yù)組、GDNF組與損傷對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，ATRA干預(yù)組與GDNF組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，ATRA+ GDNF組與ATRA干預(yù)組及GDNF組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但相比正常組和假手術(shù)組仍有差異(P＜0.05)。(5) HE染

8、色光鏡下觀察脊髓橫斷后病理變化:2周時(shí)可見(jiàn)組織壞死，神經(jīng)元變性或消失，白質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)彌散分布的小囊腔;5周時(shí)損傷區(qū)結(jié)構(gòu)紊亂，有空洞及膠質(zhì)瘢痕形成，神經(jīng)元形態(tài)趨向正常，輪廓清晰;8周時(shí)可見(jiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生并大量聚集在瘢痕周圍，部分細(xì)胞軸突再生并相互交錯(cuò)，空洞減少。(6)移植后NSCs存活情況觀察:移植后2周，損傷節(jié)段可見(jiàn)大量橘紅色BrdU標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞，主要分布于灰、白質(zhì)，高倍鏡下NSCs呈圓形或橢圓形，細(xì)胞從移植中心向四周遷移，主要聚集在纖

9、維束和空洞周圍，5周時(shí)，損傷節(jié)段仍可見(jiàn)較多BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，但灰質(zhì)內(nèi)存活的細(xì)胞數(shù)量明顯少于白質(zhì)，8周時(shí)，ATRA干預(yù)組脊髓內(nèi)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少，但ATRA+GDNF組脊髓內(nèi)仍有大量移植細(xì)胞存活。GDNF組未見(jiàn)BrdU標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞。(7)免疫熒光雙標(biāo)染色觀察:移植后2、5周ATRA干預(yù)組、ATRA+GDNF組熒光雙標(biāo)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于脊髓斷端灰、白質(zhì)空洞部位，部分向四周遷移，可見(jiàn)胞體呈現(xiàn)出草綠色熒光，向周圍伸出數(shù)條放射狀突

10、起，8周時(shí)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少，部分存活細(xì)胞伸出突起并相互交織成網(wǎng)。正常組、假手術(shù)組、損傷對(duì)照組、GDNF組未檢測(cè)到BrdU+GFAP陽(yáng)性雙染細(xì)胞;移植后2周，MAP-2陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于脊髓灰質(zhì)神經(jīng)元的胞體和突起而膠質(zhì)細(xì)胞無(wú)染色，5周時(shí)細(xì)胞數(shù)量明顯減少。正常組、假手術(shù)組、損傷對(duì)照組、GDNF組未檢測(cè)到BrdU+MAP-2陽(yáng)性雙染細(xì)胞。(8)移植后軸突生長(zhǎng)情況分析:移植后2、5、8周各組脊髓內(nèi)GFAP、MAP-2均有表達(dá)，圖像分析結(jié)

11、果表明，ATRA+GDNF組陽(yáng)性細(xì)胞面積明顯大于ATRA干預(yù)組、GDNF組及損傷對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1.體外應(yīng)用1.0μmol/L ATRA進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)可顯著促進(jìn)NSCs的增殖并促使NSCs向神經(jīng)元分化。2.移植后，NSCs能夠在損傷區(qū)域存活并向四周遷移與周圍組織整合，移植的細(xì)胞可向神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞方向分化，聯(lián)合移植可提高脊髓損傷區(qū)域神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞分化及存活的比例。3.聯(lián)合移植可有效補(bǔ)充缺失