自組裝peptide膠培養(yǎng)猴神經(jīng)干細(xì)胞及移植修復(fù)大鼠脊髓損傷.pdf

1、研究背景及目的： 脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)仍然是給社會和個人帶來沉重負(fù)擔(dān)的醫(yī)學(xué)難題。中樞神經(jīng)系統(tǒng)自我修復(fù)能力有限，脊髓損傷的治療一直是神經(jīng)科學(xué)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。 神經(jīng)干細(xì)胞(neliral stem cells，NSCs)移植成為中樞神經(jīng)損傷治療的研究重點(diǎn)，McDonald等、Ogawa等、Cao等先后將大鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植到損傷脊髓，觀察NSCs在損傷脊髓中的存活、分化及對損傷脊髓的修復(fù)，

2、均取得了一定的效果。但是，單純NSCs移植治療脊髓損傷效果并不十分顯著，移植后環(huán)境巨變，NSCs分化率低，比例不協(xié)調(diào)；組織缺損難以修復(fù)，離臨床應(yīng)用還有相當(dāng)?shù)牟罹唷?近年來組織工程的興起為細(xì)胞移植提供了出路，合適的組織工程材料能夠?yàn)橐浦布?xì)胞提供相對穩(wěn)定的局部微環(huán)境，隔絕局部神經(jīng)毒性物質(zhì)的影響，為神經(jīng)干細(xì)胞的存活、分化提供適宜的條件；同時為神經(jīng)細(xì)胞的生長和軸突再生提供支架，修復(fù)組織缺損和空洞。自組裝peptide膠作為一種新型的組織

3、工程材料擁有眾多優(yōu)勢。目前大鼠神經(jīng)干細(xì)胞與自組裝peptide納米纖維支架共培養(yǎng)已獲成功，二者聯(lián)合移植修復(fù)脊髓損傷令人期待。 目前移植研究主要集中于嚙齒類神經(jīng)干細(xì)胞移植于嚙齒類，由于嚙齒類與人類在各方面相差巨大，在進(jìn)行人類NSCs移植之前，在靈長類動物SCI模型上進(jìn)行更加詳盡的研究是非常有必要。 本實(shí)驗(yàn)擬從食蟹猴流產(chǎn)胚胎腦組織中分離、培養(yǎng)靈長類神經(jīng)干細(xì)胞，并體外觀察其在5％胎牛血清誘導(dǎo)下向神經(jīng)細(xì)胞分化；擬實(shí)現(xiàn)猴神經(jīng)干細(xì)胞

4、與自組裝peptide膠共培養(yǎng)并觀察其向神經(jīng)細(xì)胞分化，構(gòu)建NSCs組織工程復(fù)合體。同時制作大鼠脊髓打擊傷模型，將猴NSCs組織工程復(fù)合體移植治療大鼠脊髓損傷，利用BBB運(yùn)動評分、組織病理學(xué)、免疫組化檢測及超微結(jié)構(gòu)觀察等手段，分析和評價猴神經(jīng)干細(xì)胞與自組裝peptide膠聯(lián)合移植對急性SCI大鼠運(yùn)動功能的修復(fù)作用及遠(yuǎn)期效果，在組織工程聯(lián)合干細(xì)胞移植治療脊髓損傷研究領(lǐng)域進(jìn)行積極的探討。 研究方法： 取食蟹猴2～3個月流產(chǎn)胚胎

5、側(cè)腦室下區(qū)組織，分離培養(yǎng)猴NSCs，對其進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志抗原nestin細(xì)胞免疫染色鑒定；同時在5％胎牛血清的誘導(dǎo)下觀察其分化，進(jìn)行神經(jīng)元標(biāo)志MAP2、星彤膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP、少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志Oligo細(xì)胞免疫熒光染色。自組裝petide膠預(yù)鋪板，將神經(jīng)干細(xì)胞接種于已平鋪了自組裝petide膠的培養(yǎng)板中，觀察其在自組裝petide膠中的生長情況；在5％胎牛血清誘導(dǎo)下觀察其自組裝petide膠中分化，進(jìn)行神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2、星形膠

6、質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP、少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志Oligo細(xì)胞免疫熒光染色。對比分析二者的生長情況和分化比例準(zhǔn)備足量細(xì)胞，移植前使用CM-DiI熒光染料標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞。NYU打擊器致大鼠T10脊髓損傷，隨機(jī)分為四組(猴NSCs與自組裝peptide膠聯(lián)合移植組、猴NSCs移植組、自組裝peptide膠移植組，空白對照組)，損傷后即刻行移植，通過組織冰凍切片免疫熒光化學(xué)檢測猴NSCs存活及其向神經(jīng)細(xì)胞分化情況，超微結(jié)構(gòu)觀察軸突再生情況，BBB運(yùn)動功

7、能評分觀察大鼠后肢運(yùn)動功能恢復(fù)情況，分析和評價猴神經(jīng)干細(xì)胞與自組裝peptide膠聯(lián)合移植對脊髓損傷的增強(qiáng)修復(fù)作用。 結(jié)果： 1.分離培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)鑒定是猴NSCs，有良好的增殖活力，且其表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特異抗原nestin，并且可以誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞； 2.猴NSCs與自組裝peptide膠共培養(yǎng)體系初步建立成功，細(xì)胞在peptide膠中三維生長，并且可以誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及少

8、突膠質(zhì)細(xì)胞，且共培養(yǎng)組的分化率與猴NSCs單獨(dú)培養(yǎng)組相似； 3.大鼠脊髓損傷模型建立成功，移植8周后，細(xì)胞移植組大鼠BBB運(yùn)動功能評分明顯優(yōu)于空白對照組，聯(lián)合移植組優(yōu)于單純細(xì)胞移植組；聯(lián)合移植組細(xì)胞存活量較多；單純移植組神經(jīng)干細(xì)胞主要分化為表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志抗原細(xì)胞；聯(lián)合移植組，神經(jīng)干細(xì)胞可分化為表達(dá)神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志抗原細(xì)胞。 結(jié)論： 1.成功從食蟹猴流產(chǎn)胚胎腦組織中分離、培養(yǎng)出靈長類神經(jīng)