全反式維甲酸干預(yù)鼠胚神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合GDNF、ChABC移植對(duì)脊髓損傷修復(fù)的研究.pdf

1、目的:觀(guān)察1.0μmol/L全反式維甲酸（all-trans-retinoic acid, ATRA）干預(yù)培養(yǎng)鼠胚神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells，NSCs)聯(lián)合膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Glial cell line derived neurotrophic factor, GDNF）、硫酸軟骨素酶ABC(chondroitinase ABC，ChABC)共同移植至大鼠脊髓橫斷損傷部位后，移植神經(jīng)元存活情況和大鼠神經(jīng)功能

2、障礙恢復(fù)情況。
　　方法:ATRA(1.0μmol/L)干預(yù)胎鼠腦組織神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)由本課題前期實(shí)驗(yàn)完成并凍存。移植前行凍存細(xì)胞復(fù)蘇，并于移植前1d用5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Brdu-2-deoxy-uridine，BrdU）標(biāo)記。雌性Sprague-Dawleg(SD)大鼠60只，體重210～250g，隨機(jī)分為假手術(shù)組（A組，n=12）、損傷對(duì)照組（B組，n=12）、NSCs聯(lián)合GNDF移植組（C組，n=12）、NSCs聯(lián)合

3、ChABC移植組（D組，n=12）、NSCs聯(lián)合GDNF+ChABC移植組（E組，n=12）。大鼠均采用2％戊巴比妥鈉（30mg/Kg）行腹腔注射麻醉。損傷對(duì)照組、移植組大鼠于T9-11平面顯露并橫斷脊髓、蛛網(wǎng)膜下腔留置PE-10導(dǎo)管。假手術(shù)組僅行椎板切除、硬脊膜顯露和蛛網(wǎng)膜下腔留置PE-10導(dǎo)管，不損傷脊髓。術(shù)后第8d，C、D、E組大鼠經(jīng)微量注射器注入BrdU標(biāo)記NSCs10μL（細(xì)胞濃度:2×105個(gè)/μL），A、B組緩慢注射生理鹽

4、水10μL對(duì)照。C組繼續(xù)注射GDNF10μL(10ug/mL)、生理鹽水10μL（共20μL/d，連續(xù)7d），D組注射ChABC10μL(5U/mL)、生理鹽水10μL(共20μL/d，連續(xù)7d），E組注射GDNF10μL（10ug/mL）、ChABC10μL（5U/mL）(共20μL/d，連續(xù)7d);A、B組大鼠通過(guò)微量注射器經(jīng)留置導(dǎo)管注射生理鹽水20μL/d，連續(xù)7d。每組大鼠于術(shù)前1d、術(shù)后7d、末次推注細(xì)胞因子后1w、2w、5w

5、、8w各時(shí)間點(diǎn)，采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評(píng)分評(píng)估大鼠雙后肢運(yùn)動(dòng)功能，采用體感誘發(fā)電位（Somatosensory evoked potentials，SEP）評(píng)估脊髓損傷后神經(jīng)傳導(dǎo)功能恢復(fù)情況。建模術(shù)前BBB評(píng)分小于21分大鼠被排除本研究。移植8w后，大鼠再次采用戊巴比妥鈉(30mg/Kg)行腹腔注射麻醉，生理鹽水和4％中性多聚甲醛磷酸鹽緩沖液經(jīng)心臟灌注固定。沿原切口暴露損傷脊髓并取損傷節(jié)段脊髓組織行

6、HE染色觀(guān)察損傷區(qū)域改變;5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxy-uridine，BrdU)、膠質(zhì)纖維蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）和微管相關(guān)蛋白2（microtubule-associated protein-2，MAP-2）抗體行免疫組織熒光雙標(biāo)染色觀(guān)察移植NSCs細(xì)胞存活以及軸突生長(zhǎng)情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩

7、組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:(1)后肢功能障礙BBB評(píng)分結(jié)果:術(shù)后7d，損傷對(duì)照組、移植組BBB評(píng)分較假手術(shù)組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);損傷對(duì)照組、移植組各組之間比較，BBB評(píng)分差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);在移植2w后，移植組大鼠雙側(cè)后肢功能障礙逐步恢復(fù)，BBB評(píng)分較損傷對(duì)照組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在移植5w后，大鼠后肢功能障礙以

8、E組恢復(fù)最好，BBB評(píng)分較C、D組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(2) SEP潛伏期評(píng)估結(jié)果:手術(shù)建模術(shù)后7d時(shí)，損傷對(duì)照組、移植組大鼠SEP潛伏期較假手術(shù)組明顯延長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，損傷對(duì)照組、移植組組間SEP潛伏期比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。末次移植2w后，各移植組大鼠SEP潛伏期開(kāi)始縮短，移植組與損傷對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);移植5w后，E組SEP潛伏期較C、D組縮

9、短更為明顯，差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。(3)HE染色觀(guān)察:假手術(shù)組大鼠灰、白質(zhì)分界清楚，神經(jīng)纖維束排列規(guī)則，細(xì)胞輪廓清楚、結(jié)構(gòu)完整;損傷對(duì)照組損傷區(qū)血管形態(tài)欠完整，細(xì)胞排列紊亂，可見(jiàn)囊腔及膠質(zhì)瘢痕形成;移植組損傷區(qū)域細(xì)胞增生明顯，膠質(zhì)瘢痕形成，膠質(zhì)瘢痕周?chē)?jiàn)細(xì)胞增生明顯，壞死空洞較損傷對(duì)照組明顯縮小。(4)免疫組織熒光雙標(biāo)染色觀(guān)察及陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果:A、B組未見(jiàn)BrdU標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，移植組見(jiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞存活。BrdU

10、陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù):C組平均95.2±10.2個(gè)，D組平均92.7±8.9個(gè)，E組平均109.0±10.8個(gè)，E組細(xì)胞計(jì)數(shù)較C、D組多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。GFAP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù):C組平均13.5±2.5個(gè)，D組平均12.9±1.9個(gè)，E組平均10.3±2.1個(gè)，E組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞較C、D組少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MAP-2免疫組織熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)提示，C組平均11.7±2.2個(gè)，D組平均10.6±2.4個(gè)