TAG-1調(diào)節(jié)成年小鼠腦室下區(qū)神經(jīng)干細胞的增殖和神經(jīng)元分化.pdf

1、研究背景: 多年來的干細胞研究表明，NSCs的生物特點和自身內(nèi)源性因素及所處的微環(huán)境(niche)密切相關(guān)。例如，Bmi-1和TLX是表達于CNS的轉(zhuǎn)錄因子。將它們敲除后，可降低成年干細胞的增殖。這些內(nèi)源性的因子對成年NSCs的維持起特異性的作用；將SVZ細胞移植到另一個SVZ區(qū)，明顯增加了分化為嗅球(olfactorybulb，OB)神經(jīng)元的數(shù)量。但是，將SVZ細胞移植到非神經(jīng)發(fā)生的腦區(qū)，則將嚴重限制它們神經(jīng)發(fā)生的潛能。將神經(jīng)前

2、體細胞移植到神經(jīng)發(fā)生區(qū)域，它們能夠分化為此區(qū)域特異性的神經(jīng)元；將SVZ的前體細胞移植到海馬，它們能夠分化為海馬的神經(jīng)元；將SGZ的祖細胞移植到向前遷移細胞流(rostralmigrationstream，RMS)，可以產(chǎn)生OB中才具有的酪氨酸羥化酶陽性的中間神經(jīng)元，說明這種微環(huán)境影響了移植神經(jīng)元的分化類型，將這些神經(jīng)前體細胞放在體外分化，它們大多數(shù)都分化為膠質(zhì)細胞。出生后的小鼠的SVZ前體細胞在神經(jīng)軸發(fā)育中可以在許多部位分化成神經(jīng)元，當(dāng)

3、它們移植到成年腦內(nèi)時候，大多數(shù)分化為膠質(zhì)細胞。小鼠經(jīng)過非致死量放射性照射后，經(jīng)過靜脈注射成年小鼠SVZ的前體細胞，它們分化為造血細胞。將來自于成年小鼠SVZ的干細胞做上標(biāo)記，然后移植到4周齡的雞胚或者發(fā)育中的小鼠桑椹胚或者囊胚，它們能夠整合到心臟、肝臟和小腸，并且表達這些器官特異性的蛋白。大量的細胞替代療法的試驗研究顯示，移植后細胞不存活，少量存活，但是無法恢復(fù)正常功能，這些都說明，SVZ和SGZ的干細胞受其所處的微環(huán)境調(diào)節(jié)，除了調(diào)節(jié)干

4、細胞的數(shù)量，同時還決定著神經(jīng)元發(fā)生、存活。微環(huán)境指的是干細胞生活的特殊微環(huán)境，由其中的細胞、可溶性因子、限制性膜分子、血管和細胞外基質(zhì)等成分構(gòu)成，調(diào)節(jié)干細胞生理條件下的功能，能夠使得干細胞自我更新、增殖或者分化，參與組織的再生、維持和修復(fù)。因此，對干細胞自身內(nèi)源性因素和所處的微環(huán)境的了解，它們在干細胞增殖、分化中的作用、病理變化下的改變及對干細胞行為的影響是對NSCs生物行為理解的關(guān)鍵，也是將來細胞替代療法應(yīng)用的關(guān)鍵。 TAG-

5、1是一種神經(jīng)細胞粘附分子，屬于免疫球蛋白超家族的一員，主要在發(fā)育中的、成年的CNS中以一種動態(tài)的復(fù)雜的形式表達，在軸突的生長、定向及形成高度順序性的神經(jīng)連接方面起著重要的作用。APP是一種I型跨膜蛋白，類似于notch受體，包括長的胞外段和短的胞內(nèi)段，它們主要表達與腦和其它組織，并且也存在于脊椎動物、果蠅和新桿狀線蟲。經(jīng)過三種內(nèi)分泌酶α、β、γ對APP不同的部位進行剪切，產(chǎn)生Aβ。后者是被認為是產(chǎn)生AD的主要因素。 本研究小組在

6、近期首次發(fā)現(xiàn)，TAG-1作為APP的功能性的配基，在胚胎發(fā)育中觸發(fā)淀粉樣蛋白細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(APPintracellulardomain，AICD)的轉(zhuǎn)錄活化，并抑制胚胎NSCs的神經(jīng)元發(fā)生。模式圖如下。 本試驗探討成年小鼠最大的NSCs區(qū)一腦室下區(qū)NSCs的微環(huán)境分子TAG-1對其增殖、凋亡、神經(jīng)元分化的影響，理解其對小鼠NSCs增殖、分化的影響。成年體內(nèi)TAG-1/APP信號途徑對NSCs的神經(jīng)元分化還不得而知。若是抑制神經(jīng)元

7、的發(fā)生，則可以進行NSCs的siRNA干擾，沉默此信號途徑，促進NSCs向神經(jīng)元分化，恢復(fù)受損的神經(jīng)元；若此信號途徑促進NSCs的神經(jīng)元分化，可以將NSCs在體外進行基因修飾，過度表達TAG-1/APP，進一步促進NSCs向神經(jīng)元分化，恢復(fù)神經(jīng)功能而起治療作用。本實驗探索成年小鼠腦室下區(qū)NSCs分子TAG-1、APP對其生物性特性的影響，既為將來NSCs的替代療法奠定基礎(chǔ)，也為AD發(fā)病機制、可能的干細胞治療提供實驗依據(jù)。目前為止，尚未見

8、該方面的研究報道。 第一部分：TAG-1維持成年小鼠腦室下區(qū)神經(jīng)干細胞的增殖 目的：探討TAG-1分子對成年小鼠腦室下區(qū)神經(jīng)干細胞的增殖的影響 方法：用免疫組織化學(xué)和細胞化學(xué)的方法確定TAG-1在成年小鼠SVZ神經(jīng)干細胞上表達，用Westernblot實驗進一步證實。利用TAG-1基因敲除小鼠和它們的同窩仔對照進行體內(nèi)外實驗。體內(nèi)實驗，用BrdU標(biāo)記的方法，探討TAG-1對成年小鼠SVZ神經(jīng)干細胞增殖的影響，Tu

9、nel染色觀察這些神經(jīng)干細胞凋亡的變化；體外實驗，用SVZ神經(jīng)干細胞培養(yǎng)、培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞BrdU標(biāo)記觀察細胞增殖、流式細胞儀檢測神經(jīng)干細胞細胞周期及凋亡情況，觀察TAG-1基因敲除后對SVZ來源的神經(jīng)干細胞增殖、凋亡的影響。 結(jié)果：成年小時腦室下區(qū)存在神經(jīng)干細胞，它們表達神經(jīng)干細胞分子標(biāo)記nestin和SOX2。這些神經(jīng)干細胞都表達TAG-1分子，Westernblot實驗也證實了這點。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，和正常小鼠相比較，TAG-

10、1基因敲除的小鼠，SVZ神經(jīng)干細胞增殖下降有顯著性意義(t=8.251，P=0.014)，而凋亡變化無顯著性意義(t=2.000，P=1.84)。體外實驗發(fā)現(xiàn)，TAG-1基因敲除小鼠SVZ來源的神經(jīng)干細胞數(shù)量減少有顯著性意義(t=4.3437，P=0.0491)，同樣的細胞密度培養(yǎng)，TAG-1基因敲除后形成了更少的神經(jīng)球，差異有顯著性(t=12.4384，P=0.0064)；BrdU整合實驗發(fā)現(xiàn)TAG-1基因敲除后處于分裂的神經(jīng)干細胞減

11、少有顯著性意義(t=5.4240，P=0.0324)，而凋亡變化無顯著性意義(t=1.8708，P=0.1347)；流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)TAG-1基因敲除后SVZ來源的神經(jīng)干細胞分裂期縮短有顯著性意義(t=4.610，P=0.0440)，靜止期的比例增加也有顯著性意義(t=-5.817，P=0.028)，凋亡沒有變化。 結(jié)論：TAG-1表達與成年小鼠腦室下區(qū)神經(jīng)干細胞；TAG-1基因敲除后小鼠腦室下區(qū)神經(jīng)干細胞增殖明顯減少而凋亡沒

12、有變化；TAG-1維持了成年小鼠腦室下區(qū)神經(jīng)干細胞的增殖，可能通過TAG-1/APP信號途徑發(fā)揮作用。 第二部分：TAG-1調(diào)節(jié)成年小鼠腦室下區(qū)神經(jīng)干細胞的神經(jīng)元分化 目的：探討TAG-1對成年小鼠腦室下區(qū)神經(jīng)干細胞的神經(jīng)元分化的調(diào)節(jié)及可能的調(diào)節(jié)機制。 方法：利用TAG-1、APP、TAG-1/APP雙重基因敲除、Fe65基因敲除小鼠和它們的同窩仔對照進行實驗。高劑量腹腔注射BrdU(100mg/Kg)，每天注射

13、3次，連續(xù)注射2天，1個月后殺死小鼠取腦制作切片，觀察嗅球新增加是神經(jīng)元的變化情況。 結(jié)果：分別和它們的對照組相比較，TAG-1、APP基因敲除組、TAG-1/APP雙重基因敲除組，嗅球神經(jīng)元分化增加均有顯著性意義(它們分別為t=-4.798，P=0.0408；t=15.454，P=0.0042；F=0.327，t=-3.696，P=0.0209)，而Fe65基因敲除后嗅球神經(jīng)元分化變化無顯著性意義(t=-0.25，P=0.82