胚胎神經(jīng)干細(xì)胞通過調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活性促進(jìn)小鼠腦片神經(jīng)元的存活.pdf

1、神經(jīng)元的丟失是神經(jīng)退行性疾病如Parkinson disease(PD)和Alzheimer's disease(AD)的重要共同特征之一。在PD病人中的研究證明利用干細(xì)胞分化為特定的類型的細(xì)胞替代宿主丟失的神經(jīng)元有著令人期望的前景。然而在那些神經(jīng)元丟失發(fā)生于受累廣泛的腦區(qū)的神經(jīng)退行性疾病中，干細(xì)胞替代治療并沒有明顯效用。而且有很多研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)退行性疾病病程中，神經(jīng)元代謝能力的受損遠(yuǎn)早于其丟失，因此使這部分受損神經(jīng)元逃逸退化、死亡可能

2、是更吸引人的治療神經(jīng)退行性疾病的方法。事實(shí)上，有很多研究提示神經(jīng)干細(xì)胞的這一保護(hù)作用在神經(jīng)元逃逸退化、死亡上的利用。另外有大量研究顯示神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)元的退化死亡與小膠質(zhì)細(xì)胞的活性息息相關(guān)的，那么神經(jīng)干細(xì)胞促進(jìn)神經(jīng)元逃逸退化死亡是否是由于調(diào)控了小膠質(zhì)細(xì)胞的活性？
　　為驗(yàn)證假設(shè)，本實(shí)驗(yàn)首先使用拉頸處死的小鼠前額葉皮層組織切片(n=16)與小鼠胚胎來源的神經(jīng)干細(xì)胞（孕14天）體外隔離式共培養(yǎng)，對腦組織進(jìn)行細(xì)胞活性檢查(live/

3、deadkit)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):
　　1.胚胎神經(jīng)干細(xì)胞與腦片共培養(yǎng)可以促進(jìn)腦組織中神經(jīng)元的存活
　　相對于對照組（作為干細(xì)胞的對照），神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)組的腦片有更多的存活細(xì)胞(p＜0.001)和更少的死細(xì)胞(p＜0.001)，但總細(xì)胞數(shù)卻明顯減少(p＜0.001)，而且共培養(yǎng)組的腦片中間態(tài)細(xì)胞和死細(xì)胞的數(shù)目隨培養(yǎng)天數(shù)逐漸減少，存活細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比隨培養(yǎng)天數(shù)逐漸增加。
　　2.胚胎神經(jīng)干細(xì)胞促進(jìn)腦片中小膠質(zhì)細(xì)胞的活化:

4、
　?、傩∧z質(zhì)細(xì)胞的抑制劑minocycline能顯著抑制神經(jīng)元的存活。小膠質(zhì)細(xì)胞的激動劑CpG-ODN可以模擬神經(jīng)干細(xì)胞的效應(yīng)，促進(jìn)腦片中神經(jīng)元的存活。
　?、诟杉?xì)胞共培養(yǎng)組的腦片中l(wèi)ocomotory型小膠質(zhì)細(xì)胞明顯多于對照組，motile型小膠質(zhì)細(xì)胞明顯少于對照組;
　　③實(shí)時定量PCR結(jié)合westernblot從mRNA到蛋白水平檢測了小膠質(zhì)細(xì)胞活化markerIBA1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組的腦片中IBA1蛋

5、白及mRNA水平均顯著高于對照組，免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)與干細(xì)胞共培養(yǎng)組腦片中小膠質(zhì)細(xì)胞IBA1陽性細(xì)胞數(shù)多于對照組;
　?、馨l(fā)現(xiàn)與干細(xì)胞共培養(yǎng)組小膠質(zhì)細(xì)胞的效應(yīng)分子的改變，神經(jīng)干細(xì)胞顯著降低了TNFαmRNA的表達(dá)，但顯著升高IL-10mRNA的表達(dá);神經(jīng)干細(xì)胞顯著增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞保護(hù)型表型的分子CX3CR1、IGF-1和TREM2mRNA的表達(dá);
　　3.神經(jīng)干細(xì)胞通過TLR9-ERK1/2信號通路誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活
　

6、?、侔l(fā)現(xiàn)近年來報(bào)道與小膠質(zhì)細(xì)胞激活有關(guān)的TLR9的mRNA水平在共培養(yǎng)組明顯高于對照組;
　　②發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組的腦片中ERK1的磷酸化水平顯著高于對照組。
　?、郯l(fā)現(xiàn)TLR9表達(dá)、ERK1磷酸化水平與IBA-1的表達(dá)有顯著相關(guān)性。
　?、芾迷∧z質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2與神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行隔離式共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細(xì)胞顯著增強(qiáng)TLR9和IBA-1蛋白的表達(dá)，并增強(qiáng)ERK1的磷酸化水平。TLR9抑制劑氯喹的處理顯著降低T

7、LR9、IBA-1蛋白的表達(dá)及ERK1的磷酸化水平，但ERK1/2抑制劑U0126可以顯著降低ERK1磷酸化水平和IBA-1的表達(dá)，卻不能降低TLR9的表達(dá)水平。另外，TLR9配體CpG-ODN顯著性增強(qiáng)TLR9、ERK1磷酸化水平和IBA-1蛋白表達(dá)，CpG-ODN和氯喹同時處理降低了CpG-ODN誘導(dǎo)的ERK1/2，IBA-1和TLR9的表達(dá)，但是CpG-ODN和U0126同時處理降低了CpG-ODN誘導(dǎo)的ERK1/2，IBA-1表

8、達(dá)，但是不能降低CpG-ODN誘導(dǎo)的TLR9表達(dá)。
　　4.自噬蛋白可能參與神經(jīng)干細(xì)胞促進(jìn)腦片神經(jīng)元存活
　　①透射電鏡發(fā)現(xiàn)與干細(xì)胞共培養(yǎng)的組腦片中形態(tài)清晰的細(xì)胞中均含有大量的自噬體，而對照組則幾乎沒有發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象;且自噬蛋白Beclin1蛋白水平及mRNA水平在與干細(xì)胞共培養(yǎng)的腦片中確實(shí)顯著高于對照組。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用小鼠腦組織與胚胎神經(jīng)干細(xì)胞球非接觸式的共培養(yǎng)方法，進(jìn)一步證實(shí)神經(jīng)干細(xì)胞對于小鼠離體培養(yǎng)的腦片