骨髓基質細胞誘導中腦神經(jīng)干細胞分化的神經(jīng)元活性的研究.pdf

1、目的：自多潛能的神經(jīng)干細胞（Neural stem cells，NSCs）在成年小鼠紋狀體分離出來后，人們便開始探索使用NSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的可行性，發(fā)現(xiàn)體外擴增的NSCs植入腦內后，可在腦內存活、遷移和分化，更重要的是分化于NSCs的神經(jīng)元能與周圍神經(jīng)元發(fā)生整合。因此NSCs移植正成為帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病極具有前景的治療手段。骨髓基質細胞（Bone Marrow Stromal Cells，BMSCs）是一個多種細胞共存的多

2、潛能干細胞，受環(huán)境因素、激素、細胞因子等的調節(jié)，可在體內外分化為內皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、肝細胞、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞等。BMSCs表達多種細胞表面分子和分泌多種細胞因子、生長因子以及細胞外基質等，對造血干細胞的分化和發(fā)育起著決定性的作用。而調節(jié)造血干細胞的細胞因子和生長因子同樣也可調節(jié)中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，包括形態(tài)發(fā)生、神經(jīng)元和膠質細胞的分化、神經(jīng)遞質/受體的表達、突起的生長等。更重要的是造血干細胞和NP

3、Cs可表達很多共同基因，提示造血干細胞和NPCs存在類似的發(fā)育和分化機制。所以，BMSCs也應具有調節(jié)NPCs發(fā)育和分化的能力。Kawasaki等發(fā)現(xiàn)BMSCs可誘導小鼠和靈長類動物胚胎干細胞（ES）分化為神經(jīng)干細胞NSCs，后者可分化為較高比例的神經(jīng)元和一定比例的多巴胺能神經(jīng)元，提示BMSCs可提供誘導ES分化為神經(jīng)細胞的信號。那么，BMSCs是否可直接調節(jié)NSCs的分化？在體外經(jīng)BMSCs條件液誘導分化來的這些神經(jīng)元是否同成熟神經(jīng)元

4、一樣具有神經(jīng)元的功能？本研究所獲得的信息將有助于探討NSCs的分化機制和推動NSCs的應用，為NSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定了理論基礎。
　　 方法：分離培養(yǎng)BMSCs、新生大鼠中腦NSCs，實驗分為3組：1對照組（Control）：2BMSCs共培養(yǎng)組（B-CC）；3BMSCs條件液組（B-CM）； Control組和B-CM組是將神經(jīng)球種植于預先包被PLL的35mm的培養(yǎng)皿中；則是將神經(jīng)球直接種于正常生長的BMSCs表面。在神

5、經(jīng)球貼壁后Control組和B-CC組將液體更換為含2％B27的Neurobasal培養(yǎng)液，B-CM組換成BMSCs條件液。每3d換液一次。5d后進行MAP-2免疫熒光染色，Hoechst33258復染胞核后，在倒置熒光顯微鏡下每孔隨機選擇20個不同的視野，使用CCD采樣計數(shù)陽性細胞數(shù)所占的比例。在此基礎上應用BMSCs——CM誘導中腦NSCs分化為神經(jīng)元，免疫細胞化學染色方法觀察NSCs分化的神經(jīng)元是否表達突觸體素（synaptoph

6、ysin），以及應用熒光顯微數(shù)字成像系統(tǒng)檢測神經(jīng)細胞內鈣離子的改變，觀察分化的神經(jīng)元的電興奮性。將三次獨立實驗的結果一起經(jīng)SPSS統(tǒng)計軟件處理，進行顯著性分析。
　　 結果：分離培養(yǎng)BMSCs，BMSCs細胞的形狀接近于成纖維細胞。部分細胞平行排列，使用CD71抗原進行免疫化學染色，發(fā)現(xiàn)細胞99％為CD71抗原陽性。分離培養(yǎng)NSCs培養(yǎng)24 h后，出現(xiàn)2～4個細胞的細胞球。隨后細胞開始聚集形成球狀懸浮生長，球狀的NSCs隨培養(yǎng)天

7、數(shù)增加逐漸增大，形成直徑50～300個細胞的大小不等的NSCs球。神經(jīng)球內的細胞為nestin陽性。將其貼壁進行自然分化，發(fā)現(xiàn)可以分化為神經(jīng)元，星形膠質細胞和少突膠質細胞，用BMSCs、B-CM進行誘導，發(fā)現(xiàn)較自然對照組比較，在B-CC組、B-CM組，NSCs分化的神經(jīng)元比例分別為（36.81±10.17％）、（37.34±8.43％），較對照組明顯增多。在此基礎上利用免疫熒光探針技術，熒光顯微數(shù)字成像系統(tǒng)對Fura-2熒光進行采集，熒

8、光圖像經(jīng)過Mata Flour軟件進行分析，計算出平均熒光強度隨時間動態(tài)變化的曲線。細胞在靜狀態(tài)時熒光比值維持較低水平，分別給予KCl（55mmol/L）、谷氨酸（100mmol/L）后，熒光強度明顯增強，細胞鈣內流。在BMSCs條件液誘導中腦NSCs分化的神經(jīng)元分化后3d，7d和9d時進行突觸素免疫熒光染色，未見明顯的突觸素表達。至12d時可見突觸素表達，但熒光信號相對較弱，觀察不到串珠樣分布的熒光信號。至18d時，鏡下可見明亮熒光信

9、號，呈串珠狀排列在神經(jīng)元的突起上。
　　 結論：本研究證實：1.NSCs具有增殖的特性，自然狀態(tài)下可以分化為神經(jīng)元，星形膠質細胞和少突膠質細胞；2.BMSCs可以誘導NSCs分化的神經(jīng)元的比例增多，星形膠質細胞比例減少；3.B-CM與BMSCs具有同樣的作用，能夠誘導NSCs分化的神經(jīng)元的比例增多，星形膠質細胞比例減少；4.B-CM誘導NSCs分化的神經(jīng)元能夠在KCl和谷氨酸的刺激下打開鈣通道，鈣離子內流，具有電興奮性的基礎；5