體外誘導胚兔視網膜神經干細胞與腦神經干細胞向視網膜神經上皮細胞分化的研究.pdf

1、本文分兩部分論述了體外誘導胚兔視網膜神經干細胞與腦神經干細胞向視網膜神經上皮細胞分化的研究。 第一部分：胚兔視網膜及腦神經干細胞(Neural Stem Cells，NSCs)的分離、培養(yǎng)和鑒定。 目的：分離、培養(yǎng)和鑒定胚兔視網膜及腦NSCs細胞，并對不同培養(yǎng)條件進行比較。 方法：取孕24天胚兔視網膜及大腦皮質制備單細胞懸液，分別在5種不同培養(yǎng)基中進行體外培養(yǎng)，通過連續(xù)傳代使細胞純化。采用免疫熒光法及流式細胞儀檢

2、測不同培養(yǎng)條件下獲得的細胞對神經干細胞和視網膜神經上皮細胞抗原的表達。 結果：無血清培養(yǎng)基添加N2、EGF、bFGF、LIF四種因子組可以獲得最佳純化效果。傳三代后nestin(+)細胞較原代細胞明顯增高，說明懸浮培養(yǎng)法可篩選出較高純度的NSCs。視網膜NSCs培養(yǎng)過程中nestin高于大腦皮質NSCs。免疫熒光法顯示無血清培養(yǎng)條件下的兩種組織來源的NSCs都部分表達nestin。 第二部分：胚兔視網膜及腦神經干細胞NS

3、Cs的體外誘導分化。 目的：體外誘導NSCs向視網膜神經上皮細胞分化，并對不同誘導條件進行比較。 方法：選取無血清條件下傳三代的NSCs，撤去生長因子，分別在含5％FBS及5％FBS+全反式視黃酸(ATHA)的DMEM/F12培養(yǎng)基中誘導8-10天，細胞生長接近匯合時終止培養(yǎng)。通過免疫熒光、流式細胞術鑒定被誘導的細胞對神經干細胞和視網膜神經上皮細胞抗原的表達。 結果：誘導后NSCs生長速度加快，細胞主要分化為類神

4、經膠質細胞及神經元細胞。視網膜NSCs經誘導后大部分突觸較短，可見類神經節(jié)細胞；大腦皮質NSCs經誘導后大部分突觸較長，僅在經ATRA誘導后可偶然發(fā)現類神經節(jié)細胞。流式細胞術顯示兩種誘導方式都有部分細胞表達 nestin，較誘導前均明顯降低，而Rodopsin及CD90(Thy-1)的表達均較誘導前明顯增高。經5％FBS誘導的細胞表達Rodopsin較聯合應用ATRA時高，但表達CD90低于后者。與未經純化原代即以5％FBS培養(yǎng)的細胞相

5、比，經純化再誘導的細胞表達Rodopsin及CD90較高。 結論：本試驗采用懸浮篩選法成功分離和培養(yǎng)了高純度的視網膜及大腦皮質神經干細胞。無血清培養(yǎng)基添加N2、EGF、bFGF、LIF四種因子可以獲得最佳純化效果。NSCs經5％FBS或5％FBS+ATRA誘導后表達Rodopsin及CD90上調，經5％FBS誘導的細胞表達Rodopsin較聯合應用ATRA時高，但表達CD90低于后者。與未經純化原代即以5％FBS培養(yǎng)的細胞相比，