胚胎神經(jīng)干細(xì)胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、各種急慢性的視神經(jīng)病變均可能引起不同程度的視覺障礙，保護(hù)或修復(fù)損傷的視覺功能，對(duì)恢復(fù)患者正常的工作、生活有重要的意義。但目前對(duì)視神經(jīng)損傷的治療效果多不理想，視神經(jīng)損傷后出現(xiàn)不可逆視覺障礙的一個(gè)重要原因是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突損傷后引起神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡。雖然采用多種方法，但哺乳動(dòng)物視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活與軸突再生能力仍非常有限。 神經(jīng)干細(xì)胞是存在于胚胎及成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)的具有自我更新、多向分化潛能的細(xì)胞，具有治療中樞神經(jīng)

2、系統(tǒng)疾病的巨大潛力。使用神經(jīng)干細(xì)胞移植治療多種神經(jīng)系統(tǒng)病變，替代損傷的神經(jīng)元，為中樞神經(jīng)再生研究帶來了希望。但影響神經(jīng)干細(xì)胞分化的因素非常復(fù)雜，單純移植神經(jīng)干細(xì)胞后分化為特定神經(jīng)元的比例非常低。 如果給特定來源的神經(jīng)干細(xì)胞一特定的局部微環(huán)境，根據(jù)腦內(nèi)相關(guān)部位的細(xì)胞類型及細(xì)胞結(jié)構(gòu)特異性，在體外誘向分化，則有可能使神經(jīng)干細(xì)胞在體外向某一方向分化(如視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)，損傷視功能的修復(fù)就有可能實(shí)現(xiàn)。 該實(shí)驗(yàn)探索將神經(jīng)干細(xì)胞多向

3、分化潛能和自我更新特性與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境結(jié)合起來，在體外誘導(dǎo)不同來源的神經(jīng)干細(xì)胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化，從而為修復(fù)視功能損傷提供一個(gè)新的發(fā)展思路。 一、不同來源胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定 目的 分別從腦發(fā)育過程中較為原始的海馬腦區(qū)與中腦背側(cè)的上丘腦區(qū)中分離、培養(yǎng)胚胎神經(jīng)干細(xì)胞，并進(jìn)行比較。 方法 從孕14天的SD大鼠胚胎的海馬和中腦背側(cè)上丘中分離神經(jīng)干細(xì)胞，采用無血清培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)

4、胚胎神經(jīng)干細(xì)胞。在相差顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，測(cè)定其體外生長(zhǎng)曲線。將神經(jīng)干細(xì)胞與Brdu共孵育，通過免疫熒光染色方法觀察干細(xì)胞體外增殖情況。使用免疫熒光染色方法對(duì)兩種來源的神經(jīng)干細(xì)胞克隆球進(jìn)行鑒定，通過激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行三維形態(tài)觀察，使用掃描電鏡進(jìn)行克隆球表面形態(tài)研究。 結(jié)果 大鼠胚胎海馬細(xì)胞和上丘細(xì)胞在接種后，倒置顯微鏡下觀察均可見細(xì)胞呈小圓形，并有部分破碎的細(xì)胞碎片混雜其中。大鼠胚胎海馬細(xì)胞在培養(yǎng)4天后，培養(yǎng)

5、液明顯黃變。此時(shí)，大部分細(xì)胞死亡，存活的部分細(xì)胞胞體增大，折光性增強(qiáng)，出現(xiàn)分裂相，細(xì)胞可成對(duì)出現(xiàn)，并漸形成散在的細(xì)胞團(tuán)(多由4-10個(gè)細(xì)胞組成)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，干細(xì)胞球逐漸增大，可由數(shù)百個(gè)細(xì)胞組成。干細(xì)胞球邊緣細(xì)胞折光性較強(qiáng)，伴有光暈，中心透光性較差。海馬源胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的體外生長(zhǎng)情況與上丘源干細(xì)胞基本相同，但增殖速度相對(duì)較慢。而大鼠上丘源胚胎神經(jīng)細(xì)胞在培養(yǎng)48h后培養(yǎng)液就明顯黃變，傳代培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)其增殖速度較快。兩種來源傳代培養(yǎng)的

6、干細(xì)胞球均呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，無明顯突起。當(dāng)細(xì)胞傳至第2代時(shí)，培養(yǎng)液中已無原代時(shí)的細(xì)胞碎片，黃變時(shí)間也有所延長(zhǎng)。在相差顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下，兩種來源的神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)相似。在掃描電鏡下，神經(jīng)干細(xì)胞克隆中心部位細(xì)胞排列疏松、周邊部細(xì)胞排列緊密，邊緣部位可見有不同類型的細(xì)胞爬出，遷移出的細(xì)胞形態(tài)多樣，其中以膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞為主，相互間有突起交叉聯(lián)結(jié)。通過與Brdu共孵育，發(fā)現(xiàn)上丘源胚胎神經(jīng)細(xì)胞的陽(yáng)性率要高于海馬源干細(xì)胞，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義(p

7、＜0.05)。從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線上可見兩種來源的NSCs在無血清懸浮培養(yǎng)條件下，都呈現(xiàn)了相同的增殖趨勢(shì)，但兩者的生長(zhǎng)曲線并不相同。對(duì)同一時(shí)間點(diǎn)的活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行T檢驗(yàn)，可以發(fā)現(xiàn)從培養(yǎng)第8天起，上丘源胚胎神經(jīng)細(xì)胞的活細(xì)胞記數(shù)就高于海馬源干細(xì)胞，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義(p＜0.05)。 結(jié)論 使用機(jī)械分離、無血清培養(yǎng)的方法可以獲得胚胎海馬源與上丘源神經(jīng)干細(xì)胞，兩者具有相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，均具有體外增殖能力。雖然兩種來源的神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)過程相

8、似，但上丘來源的神經(jīng)干細(xì)胞增殖速度高于海馬來源的神經(jīng)干細(xì)胞。 二、視路結(jié)構(gòu)(視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、上丘)組織培養(yǎng) 目的 建立SD大鼠視路結(jié)構(gòu)(視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、上丘)組織培養(yǎng)的方法，探索其理想的體外培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時(shí)間。 方法 1.將出生4d的乳鼠與3月齡的SD大鼠分別分入3組，分別在用鼠尾膠原玻片、多聚賴氨酸玻片和PET微孔濾膜上進(jìn)行組織培養(yǎng)，觀察視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、上丘的生長(zhǎng)情況，使用相差顯微鏡動(dòng)

9、態(tài)觀察組織塊生長(zhǎng)情況。在培養(yǎng)后48小時(shí)觀察組織塊貼壁率，在培養(yǎng)5天時(shí)使用圖象分析儀觀察細(xì)胞遷移情況，測(cè)量最大遷移距離。 2.分別將乳鼠與成年鼠的視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、上丘組織種植在PET膜上培養(yǎng)。從接種后12小時(shí)開始(d1)，每72小時(shí)每孔取上清50μl，使用乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒，測(cè)量組織培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶的活性。常規(guī)HE染色形態(tài)學(xué)觀察，并使用透射電鏡觀察組織塊超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果 1.與傳統(tǒng)的培養(yǎng)載體相比，視路組織

10、在PET膜上進(jìn)行組織培養(yǎng)可以獲得較高的組織貼壁率和細(xì)胞遷移距離。 2.視網(wǎng)膜的組織培養(yǎng)：兩組視網(wǎng)膜組織塊均在72h內(nèi)見有細(xì)胞突起發(fā)出，并逐漸出現(xiàn)細(xì)胞遷移。培養(yǎng)5天后HE染色可見視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)基本存在。透射電鏡觀察可見細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整。 3.視神經(jīng)的組織培養(yǎng)：視神經(jīng)在培養(yǎng)早期即有細(xì)胞從植塊邊緣游出，逐漸發(fā)出突起。新生大鼠組較早出現(xiàn)細(xì)胞遷移。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，視神經(jīng)結(jié)構(gòu)逐漸消失，成為大片的膠質(zhì)細(xì)胞。 4.上

11、丘的組織培養(yǎng)：新生大鼠組上丘組織中出現(xiàn)細(xì)胞突起，透射電鏡觀察隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞之間出現(xiàn)凋亡，結(jié)構(gòu)破壞。 5.PET膜上培養(yǎng)的組織在接種后3-15天，其培養(yǎng)液中LDH活性可以保持在較低水平。 結(jié)論 在特定的培養(yǎng)條件下，可以在體外進(jìn)行視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、上丘組織培養(yǎng)。接種3天后組織生長(zhǎng)趨于旺盛，而在2周后部分組織的生長(zhǎng)逐漸衰退。 三、不同條件下神經(jīng)干細(xì)胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 目的

12、 研究海馬源與上丘源胚胎神經(jīng)干細(xì)胞在體外的誘導(dǎo)分化，探討神經(jīng)干細(xì)胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化的條件 方法 神經(jīng)干細(xì)胞體外分化實(shí)驗(yàn)分為2組：共培養(yǎng)組與自然分化組。其中共培養(yǎng)組又分為4個(gè)亞組：視神經(jīng)離斷組、假手術(shù)組、空白對(duì)照組、新生大鼠組；共培養(yǎng)組使用雙室組織-細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)分別將不同組視路組織與兩種神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)。該系統(tǒng)由上下兩室組成。上室為透明PET微孔(孔徑0.4μm)濾膜培養(yǎng)小室，用于接種培養(yǎng)大鼠視路組織。下室為配

13、套的培養(yǎng)板，可將上室懸吊起來。將傳4代的兩種神經(jīng)干細(xì)胞分別種植在用多聚賴氨酸包被的玻片上，置入雙室組織-細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的下室，放入CO2培養(yǎng)箱中于37℃，5％CO2條件下貼壁培養(yǎng)。43天后，取已培養(yǎng)4d的組織移入共培養(yǎng)系統(tǒng)中，與在已玻片上培養(yǎng)3d的干細(xì)胞共培養(yǎng)。待共培養(yǎng)6d后，將上室移出。干細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)5天后固定，使用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞的分化情況。神經(jīng)干細(xì)胞自然分化組，除不使用組織共培養(yǎng)外，其他與共培養(yǎng)組相同。 結(jié)果

14、 1.胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的自然分化過程：兩種來源的神經(jīng)干細(xì)胞克隆，在培養(yǎng)24h后可以貼壁，隨著時(shí)間延長(zhǎng)克隆球逐漸變扁平，并以克隆為中心產(chǎn)生放射狀細(xì)胞遷移，細(xì)胞呈梭形和多角形，部分細(xì)胞可見長(zhǎng)突起，細(xì)胞的折光性也各有不同。免疫熒光標(biāo)記顯示大部分分化細(xì)胞為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP陽(yáng)性)，少量為神經(jīng)元(MAP-2陽(yáng)性)，未見有視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化(Thy1.1陰性)。 2.視神經(jīng)離斷組：視路結(jié)構(gòu)(視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、上丘)組織與神經(jīng)干細(xì)胞共培

15、養(yǎng)后，干細(xì)胞貼壁時(shí)間與自然分化組相同，但細(xì)胞分化程度明顯高于自然分化組，細(xì)胞突起的長(zhǎng)度明顯增加。上丘組織與中腦上丘源神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)后分化的細(xì)胞中可見視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Thy1.1陽(yáng)性)。 3.假手術(shù)組與成年大鼠空白對(duì)照組：視路結(jié)構(gòu)(視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、上丘)組織與神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)后，干細(xì)胞貼壁分化程度高于自然分化組，未見視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化(Thy1.1陰性)。 4.新生大鼠組：共培養(yǎng)后，干細(xì)胞貼壁時(shí)間也與自然分化組相同，