視網(wǎng)膜前體細(xì)胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 目的：分離和培養(yǎng)不同時(shí)期的RPCs并鑒定。 方法：分離E14和E18SD大鼠的RPCs，用改進(jìn)DMEM／F12無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)并在體外誘導(dǎo)分化，倒置相差顯微鏡每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化情況，免疫細(xì)胞化學(xué)、掃描電鏡和透射電鏡對(duì)RPCs進(jìn)行鑒定。 結(jié)果：RPCs在DMEM／F12無(wú)血清培養(yǎng)基中懸浮成球，貼壁后，細(xì)胞逐漸從細(xì)胞球向周圍遷移分化。掃描電鏡可見細(xì)胞球和分化細(xì)胞的形態(tài)，透

2、射電鏡可見細(xì)胞球內(nèi)存在RPCs樣細(xì)胞，貼壁后形成神經(jīng)元樣和神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞球中大部分細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)外胚層源性干細(xì)胞標(biāo)志Nestin和細(xì)胞分裂增殖標(biāo)志BrdU，貼壁后，RPCs能分化為多種視網(wǎng)膜細(xì)胞類型，包括Thyl．1陽(yáng)性的RGCs。E14和E18RGCs％分別為16．91％±4．05％和4．65％±L88％，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(仁15．04，P

3、清培養(yǎng)基可成功培養(yǎng)RPCs，培養(yǎng)的RPCs具有無(wú)限增殖和多向分化潛能。早期RPCs向RGCs分化的百分比較高 第二部分眼內(nèi)微環(huán)境對(duì)視網(wǎng)膜前體細(xì)胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化的影響 目的：研究視神經(jīng)鉗夾傷模型對(duì)RPCs向RGCs分化的影響。 方法：成年雄性SD大鼠，隨機(jī)選取左右眼進(jìn)入試驗(yàn)，試驗(yàn)組為視神經(jīng)鉗夾傷模型，對(duì)照組暴露視神經(jīng)，但不鉗夾。分離培養(yǎng)E14SD大鼠的RPCs，用BrdU標(biāo)記后分別移植到試驗(yàn)組和對(duì)照組的玻璃

4、體腔，于移植后1w，2w，4w取眼球，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)移植細(xì)胞的遷移、整合和分化情況。 結(jié)果：對(duì)照組移植的RPCs主要位于宿主玻璃體腔，隨著時(shí)間的推移，未見明顯的遷移和分化。試驗(yàn)組移植的RPCs逐漸向宿主視網(wǎng)膜各層遷移，其中位于內(nèi)層視網(wǎng)膜的細(xì)胞數(shù)量明顯多于外層視網(wǎng)膜，以GCL為最多，隨著時(shí)間的推移，外層視網(wǎng)膜的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，但仍明顯少于內(nèi)層視網(wǎng)膜。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示試驗(yàn)組位于宿主視網(wǎng)膜不同層的移植細(xì)胞表達(dá)不同的視網(wǎng)膜細(xì)胞特異性

5、標(biāo)志，Thyl．1陽(yáng)性的細(xì)胞主要位于GCL，其次是INL。 結(jié)論：視神經(jīng)鉗夾傷模型能誘導(dǎo)RPCs遷移到GCL并向RGCs分化。 第三部分Muller細(xì)胞對(duì)視網(wǎng)膜前體細(xì)胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化的作用 目的：研究Muller細(xì)胞和MCM在RPCs向RGCs分化中的作用。 方法：分離培養(yǎng)P7SD大鼠的Muller細(xì)胞，E14和E18SD大鼠的RPCs，分別將不同時(shí)期的RPCs單獨(dú)培養(yǎng)(MuUer(一)組)，與M

6、uller細(xì)胞共同培養(yǎng)(№1ler(+)組)，用MCM誘導(dǎo)分化(MCM組)。倒置相差顯微鏡每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化情況，Thyl．1標(biāo)記RGCs并計(jì)數(shù)。 結(jié)果：不同時(shí)期，不同培養(yǎng)條件下的RPCs都能分化為多種視網(wǎng)膜細(xì)胞類型，包括ThyL1陽(yáng)性的RGCs，但RPCs向一RGCs分化的百分比不同。E14，Muller(一)組，Muller(+)組和MCM組RGCs％分別為16．91％+4．05％，47．25％+9．67％和42．36

7、％-t-10．52％，E18則分別為4．65％4-1．88％，9．90％±3．19％和8．69％--+3．01％。Muller(+)組、MCM組與Muller(一)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0．05)。E14，Muller(一)組和MCM組RPCs增生細(xì)胞％分別為32．13％-+6．11％和57．07％-+9．31％，E18則分別為3L51％-+6．32％和56

8、．18％-+8．79％，MCM組與Mu／ler(一)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tE14m12．28，P＜O．001；tE18=12．49，P

9、培養(yǎng)E14SD大鼠的RPCs，試驗(yàn)組和對(duì)照組分別用含有Notch-1反義寡核苷酸鏈和無(wú)關(guān)序列寡核苷酸鏈的分化培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)分化，倒置相差顯微鏡每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化情況，Thyl．1標(biāo)記RGCs并進(jìn)行計(jì)數(shù)。 結(jié)果：試驗(yàn)組和對(duì)照組的RPCs都能分化為多種視網(wǎng)膜細(xì)胞類型，包括Thyl．1陽(yáng)性的RGCs，但兩組RPCs向RGCs分化的百分比不同。試驗(yàn)組和對(duì)照組RGCs％分別為16．57％±4．31％和31．19％+6．90％，兩組比

10、較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9．84，P＜0．001)。 結(jié)論：Notch-1對(duì)RGCs的分化具有負(fù)向調(diào)控作用，阻斷Notch-1能促進(jìn)RPCs向RGCs分化。 第五部分Math5調(diào)控視網(wǎng)膜前體細(xì)胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化目的：研究Math5對(duì)RPCs向RGCs分化的調(diào)控作用。 方法：分離培養(yǎng)E14SD大鼠的RPCs，構(gòu)建Math5-EGFP質(zhì)粒，以EGFP質(zhì)粒作為對(duì)照，轉(zhuǎn)染RPCs，倒置相差顯微鏡每天觀察轉(zhuǎn)染后RP

11、Cs的生長(zhǎng)和分化情況，重點(diǎn)觀察其向RGCs的分化，Thyl．1標(biāo)記RGCs并進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)用熒光定量RT-PCR的方法檢測(cè)RPCs分化不同時(shí)間點(diǎn)Math5相關(guān)基因的表達(dá)情況。 結(jié)果：Math5-EGFP／EGFP質(zhì)粒能成功轉(zhuǎn)染RPCs，轉(zhuǎn)染效率為24．68％。轉(zhuǎn)染后的RPCs仍能分化為多種視網(wǎng)膜細(xì)胞類型，包括Thyl．1陽(yáng)性的RGCs。A組(Math5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組)，B組(空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組)和C組(未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組)RGCs％分別為30．

12、85％±6．28％，15．84％~3．55％和16．22％±3．60％，A組與B組、C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P