α晶體蛋白促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突再生的機(jī)制研究.pdf

1、α晶體蛋白是晶狀體來(lái)源的“神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)”之一，它能有效地促進(jìn)損傷后的視神經(jīng)再生，但其作用機(jī)制不明。視神經(jīng)損傷后RGCs的繼發(fā)性死亡，是視神經(jīng)難以再生的原因之一，但是，單純保護(hù)RGCs存活并不能引起視神經(jīng)的有效再生，因?yàn)閾p傷局部環(huán)境中的抑制性物質(zhì)是阻礙視神經(jīng)再生的另一關(guān)鍵因素。這些抑制性物質(zhì)主要有髓鞘源性抑制物，膠質(zhì)瘢痕來(lái)源的抑制物，以及生長(zhǎng)錐導(dǎo)向抑制物。目前研究已證明：RhoA/Rock的表達(dá)與活性變化對(duì)中樞神經(jīng)元軸突再生有著直接影響，

2、是眾多軸突再生抑制物信號(hào)傳導(dǎo)的共同作用點(diǎn)。而α晶體蛋白不僅能促進(jìn)RGCs存活，而且對(duì)RGCs軸突再生也具有明顯促進(jìn)作用。那么，阻礙軸突再生抑制物信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)節(jié)點(diǎn)----RhoA/Rock信號(hào)通路的傳導(dǎo)，是否是α晶體蛋白促進(jìn)視神經(jīng)再生的機(jī)制?目前尚不清楚。 目的：通過(guò)在髓鞘抑制物質(zhì)包被的培養(yǎng)板上培養(yǎng)RGCs，研究α晶體蛋白是否能拮抗髓鞘抑制物的作用而促進(jìn)RGCs突起生長(zhǎng)。而后分別通過(guò)在體視神經(jīng)不全損傷大鼠模型和離體RGCs培養(yǎng)，研

3、究α晶體蛋白對(duì)RhoA、Rock的表達(dá)和活化情況，其下游物質(zhì)磷酸化情況，RGCs軸突再生及生長(zhǎng)錐萎縮情況的影響。從而探討RhoA/Rock信號(hào)通路在α晶體蛋白促進(jìn)視神經(jīng)再生中的作用。為視神經(jīng)損傷和再生的基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)，為臨床治療視神經(jīng)損傷探索可行方法。 方法：1、從大鼠晶狀體中提取混合晶體蛋白，用分子排阻凝膠色譜法純化分離α晶體蛋白，肽指紋質(zhì)譜法鑒定其純度；從大鼠腦組織中提取髓鞘抑制物質(zhì)，并對(duì)其成份及抑制神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)的功

4、能進(jìn)行鑒定。2、在體實(shí)驗(yàn)：以成年Long Evans大鼠為研究對(duì)象，分為視神經(jīng)損傷后玻璃體腔注射α晶體蛋白組、RhoA/Rock抑制劑組(陽(yáng)性對(duì)照組)，和牛血清白蛋白組(陰性對(duì)照組)。通過(guò)western blot分析統(tǒng)計(jì)視網(wǎng)膜中RhoA/Rock表達(dá)變化，親和沉淀法研究RhoA活性變化，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。同時(shí)視神經(jīng)順行示蹤檢測(cè)各組視神經(jīng)再生長(zhǎng)度。3、離體實(shí)驗(yàn)：在髓鞘抑制物包被的培養(yǎng)板上進(jìn)行RGCs離體培養(yǎng)，分析比較培養(yǎng)1、3、5d，α晶

5、體蛋白組與陽(yáng)性和陰性對(duì)照組有突起的細(xì)胞數(shù)、最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度及cofilin和MLC磷酸化程度的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)觀察各組生長(zhǎng)錐的萎縮情況。 結(jié)果：1、從大鼠晶狀體中提取并純化的α晶體蛋白經(jīng)肽質(zhì)紋質(zhì)譜分析為alphaA-crystalline和alphaB-crystalline的混合物。western blot檢測(cè)提取的髓鞘抑制物中含有髓鞘抑制物NogoA和MAG；在RGCs培養(yǎng)液中加入髓鞘抑制物1小時(shí)后，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)差，出現(xiàn)細(xì)胞碎片

6、，生長(zhǎng)錐的膨大明顯縮小，板足回退；2h后生長(zhǎng)錐萎縮消失，RGCs突起斷裂。在髓鞘抑制物質(zhì)包被的培養(yǎng)板上培養(yǎng)RGCs，培養(yǎng)1d、2d、3d、5d，α晶體蛋白組有突起的細(xì)胞數(shù)均較牛血清白蛋白組增多，突起長(zhǎng)度也明顯長(zhǎng)于牛血清白蛋白組(P<0.01)。 2、正常成年大鼠視網(wǎng)膜中，僅RGCs層可見(jiàn)少量RhoA和Rock表達(dá)；視神經(jīng)損傷后1天，RhoA和Rock主要分布于RGCs層；損傷3天達(dá)內(nèi)叢狀層；損傷7天后，分布于RGCs、內(nèi)叢狀層、

7、內(nèi)核層及外叢狀層。 3、視神經(jīng)損傷后1、3、7天，RhoA和Rock的表達(dá)均高于正常組(P<0.01～0.05)，并且活化的RhoA均較正常組明顯增多(P<0.01)。 4、視神經(jīng)損傷后，α晶體蛋白組、fasudil組及C3轉(zhuǎn)移酶組，活化的RhoA均較牛血清白蛋白組明顯減少(P<0.01～0.05)。但各組RhoA和Rock在視網(wǎng)膜中的表達(dá)量均無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 5、視神經(jīng)損傷后2周，牛血清白蛋白組僅可見(jiàn)極少量的

8、神經(jīng)纖維長(zhǎng)入損傷區(qū)。而α晶體蛋白組及fasudil組，不僅損傷區(qū)可見(jiàn)較多的神經(jīng)纖維長(zhǎng)入，而且，神經(jīng)纖維越過(guò)損傷區(qū)長(zhǎng)入損傷區(qū)的遠(yuǎn)端。 6、在蛋白上樣量基本一致的情況下，α晶體蛋白組和fasudil組磷酸化-cofilin和磷酸化-MLC占總cofilin和總MLC的比率，均明顯少于牛血清白蛋白組(P<0.01)，α晶體蛋白組和fasudil組比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 7、在髓鞘抑制物質(zhì)包被的培養(yǎng)板上培養(yǎng)RGCs，培養(yǎng)1、3、

9、5d，α晶體蛋白組和fasudil組有突起的RGCs數(shù)目均明顯多于牛血清白蛋白組(P<0.01)，細(xì)胞最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度也顯著增長(zhǎng)(P<0.01)。與α晶體蛋白組比較，培養(yǎng)1d時(shí)，有突起的細(xì)胞數(shù)fasudil組明顯增多(P<0.01)；培養(yǎng)3d和5d時(shí)，兩組無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但fasudil組細(xì)胞最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度，于培養(yǎng)1、3、5d均較α晶體蛋白組明顯增長(zhǎng)(P<0.01)。 8、未加髓鞘的正常生長(zhǎng)錐末端可見(jiàn)明顯的膨大，并且可見(jiàn)較多的細(xì)小指

10、狀突起。加入髓鞘后，牛血清白蛋白組細(xì)胞突起末端膨大的生長(zhǎng)錐消失，呈斷裂狀且未見(jiàn)細(xì)小分支；α晶體蛋白組和fasudil組細(xì)胞突起末端仍可見(jiàn)較小的膨大，并且可見(jiàn)少量的指狀突起。 結(jié)論：1、視神經(jīng)損傷可顯著增加RhoA、Rock在視網(wǎng)膜中的表達(dá)量，擴(kuò)大其在視網(wǎng)膜中的分布范圍，并顯著增強(qiáng)RhoA活性。RhoA/Rock在視神經(jīng)損傷后再生過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。 2、α晶體蛋白能拮抗髓鞘抑制物質(zhì)的抑制作用促進(jìn)RGCs軸突再生。