α晶狀體蛋白對(duì)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用研究.pdf

1、視神經(jīng)損傷后如何修復(fù),提高其臨床治療效果,一直是神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)。近年來,外源性α晶狀體蛋白在視神經(jīng)損傷后修復(fù)中發(fā)揮的作用日益受到人們關(guān)注。已有的研究表明,α晶狀體蛋白對(duì)RGCs的存活和突起生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用,是重要的晶狀體源性“神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)”。同時(shí),α晶狀體蛋白還可以通過抑制視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、遷移及活化,降低細(xì)胞中TNF-α、iNOS蛋白的濃度及mRNA的表達(dá),減輕其對(duì)RGCs的損害。既往文獻(xiàn)證實(shí),當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激刺激和其它損傷

2、因素作用時(shí),可啟動(dòng)胞內(nèi)HSPs基因,促使HSPs合成,從而對(duì)細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。因此,α晶狀體蛋白作為熱休克蛋白家族成員,是否參與了視神經(jīng)損傷后的內(nèi)源性保護(hù)?視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是否能表達(dá)內(nèi)源性α晶狀體蛋白?倘若視神經(jīng)損傷后,能使視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞高表達(dá)α晶狀體蛋白,是否具有更為理想的神經(jīng)保護(hù)作用?上述問題均未見文獻(xiàn)報(bào)道。由此,進(jìn)一步探討內(nèi)源性α晶狀體蛋白在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的變化和作用,可能為臨床治療視神經(jīng)損傷提供新的途徑。
　　

3、 [目的]
　　 通過建立大鼠視神經(jīng)鉗夾傷模型,進(jìn)一步明確外源性α晶狀體蛋白對(duì)神經(jīng)損傷后軸突生長(zhǎng)的定量變化;通過離體和在體研究,探討視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中內(nèi)源性α晶狀體蛋白的表達(dá);在此基礎(chǔ)上,采用腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù),分析α晶狀體蛋白高表達(dá)對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響。從而闡明α晶狀體蛋白在視神經(jīng)損傷所誘導(dǎo)的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡中的作用,并為基因治療或合成新型的短肽藥物治療視網(wǎng)膜視神經(jīng)損傷奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 [方法]

4、　　 1、以成年Long Evans大鼠為研究對(duì)象,建立視神經(jīng)鉗夾損傷模型,玻璃體腔單次注射10-4g/L外源性α晶狀體蛋白。通過視神經(jīng)冠狀切片和神經(jīng)軸突鍍銀染色方法,利用計(jì)算機(jī)圖象分析系統(tǒng),分別于損傷后1、2、4周,定量分析和比較視神經(jīng)損傷遠(yuǎn)端0.5mm、2mm、5mm處的視神經(jīng)軸突數(shù)量。
　　 2、原代培養(yǎng)新生大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,通過免疫熒光染色和激光共聚焦顯微鏡,觀察培養(yǎng)的細(xì)胞中內(nèi)源性α晶狀體蛋白的表達(dá),并采用RT-P

5、CR方法檢測(cè)細(xì)胞中內(nèi)源性α晶狀體蛋白mRNA的表達(dá)規(guī)律。同時(shí),利用成年大鼠視神經(jīng)鉗夾損傷模型和全視網(wǎng)膜鋪片的免疫組化方法,觀察視神經(jīng)損傷對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中內(nèi)源性α晶狀體蛋白表達(dá)的影響。
　　 3、利用同源重組原理,將α晶狀體蛋白cDNA克隆入腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV,構(gòu)建攜帶α晶狀體蛋白編碼基因的重組腺病毒表達(dá)載體。脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,獲得重組腺病毒質(zhì)粒Ad-Crystallina。
　　 4、將重組

6、腺病毒Ad-crystallina感染培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,并給予缺氧刺激,通過RT-PCR和werstern blot檢測(cè)細(xì)胞中α晶狀體蛋白、caspase-3、bcl-2的表達(dá)水平,探討α晶狀體蛋白高表達(dá)對(duì)缺氧后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響。
　　 [結(jié)果]
　　 1、視神經(jīng)損傷后,神經(jīng)軸突數(shù)量的改變主要發(fā)生在損傷后2周內(nèi),并且離損傷點(diǎn)越近,其神經(jīng)軸突數(shù)量減少越明顯。通過單次玻璃體腔給藥途徑,外源性α晶狀體蛋白可

7、以顯著減少大鼠視神經(jīng)損傷后神經(jīng)軸突數(shù)量的丟失。但在損傷后4周,α晶狀體蛋白的神經(jīng)保護(hù)作用明顯減弱。
　　 2、用新生大鼠進(jìn)行視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞原代培養(yǎng),培養(yǎng)的RGCs可表達(dá)內(nèi)源性α晶狀體蛋白,陽(yáng)性染色位于RGCs胞膜和軸突。在原代培養(yǎng)第3～5d的RGCs中,內(nèi)源性α晶狀體蛋白mRNA的表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.05)。
　　 3、正常成年大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)源性α晶狀體蛋白表達(dá)為陰性。而視神經(jīng)鉗夾傷后的成年大鼠視網(wǎng)膜中可見內(nèi)

8、源性α晶狀體蛋白陽(yáng)性表達(dá)。
　　 4、采用RT-PCR方法成功擴(kuò)增crystallina目的片段,KpnⅠ和HindⅢ雙酶切重組質(zhì)粒pAdTrack-CMV-crystallina,蛋白電泳及測(cè)序結(jié)果顯示質(zhì)粒構(gòu)建成功,可觀察到載體片段和目的基因片段。質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1同源重組成功后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,進(jìn)行5次傳代純化后獲得重組腺病毒Ad-crystallina。所獲得的腺病毒滴度為1.143×109 ifu/mL

9、。
　　 5、Ad-crystallina可在培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中高表達(dá)。與單純?nèi)毖踅M相比,缺氧刺激后Ad-crystallina轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中α晶狀體蛋白表達(dá)量約為單純?nèi)毖踅M細(xì)胞的1.8倍,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P＜0.05)。
　　 6、給予細(xì)胞缺氧刺激后,與單純?nèi)毖踅M相比,Ad-crystallina轉(zhuǎn)染組RGCs中caspase-3的蛋白表達(dá)水平下降59％,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異非常顯著(P＜0.01)。
　　 [結(jié)

10、論]
　　 1、α晶狀體蛋白在視神經(jīng)損傷后修復(fù)中發(fā)揮重要作用。通過玻璃體腔注射途徑單次給藥,可明顯減少受損視神經(jīng)軸突數(shù)量的丟失。
　　 2、在離體條件下,原代培養(yǎng)的新生大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有內(nèi)源性α晶狀體蛋白表達(dá)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,視神經(jīng)損傷可以誘發(fā)成年大鼠視網(wǎng)膜表達(dá)內(nèi)源性α晶狀體蛋白,提示α晶狀體蛋白可能參與了視網(wǎng)膜內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 3、成功構(gòu)建了高表達(dá)α晶狀體蛋白的重組腺病毒質(zhì)粒。
　　 4、腺