慢性高眼壓視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)行性死亡的線粒體機(jī)制.pdf

1、前言
　　青光眼視神經(jīng)病變是全球首位不可逆致盲眼病。主要表現(xiàn)為以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell，RGCs)進(jìn)行性丟失為病理基礎(chǔ)的特征性視神經(jīng)損害和視野缺損。目前認(rèn)為高眼壓是主要的危險(xiǎn)因素和始動(dòng)因素。然而，單純降低眼壓只能從一定程度上緩解病情的發(fā)展卻不能遏制繼發(fā)性RGCs死亡及其軸突的潰變。從而使得臨床上有效控制視神經(jīng)病變發(fā)展的手段有限。
　　青光眼和線粒體視神經(jīng)病變?cè)诓±硖卣骱团R床表現(xiàn)上的諸多相

2、似性使線粒體在青光眼視神經(jīng)病變中的作用受到越來越多的重視和關(guān)注。此外，現(xiàn)已證實(shí)線粒體功能障礙在阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)變性疾病中起了重要作用。青光眼也屬于神經(jīng)變性類疾病，具有這些疾病的共同特點(diǎn):年齡相關(guān)性、神經(jīng)元選擇性、進(jìn)行性丟失。這些證據(jù)都提示線粒體在青光眼發(fā)展中扮演重要角色的可能性。那么:線粒體在RGCs進(jìn)行性死亡過程中發(fā)生了哪些改變？是否可以解釋臨床上一些患者在眼壓有效控制以后，視力損害仍然持續(xù)加重的現(xiàn)象？這些問題尚未見報(bào)道。

3、
　　線粒體被稱為細(xì)胞內(nèi)的能量工廠，對(duì)于細(xì)胞的存活和死亡起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。線粒體DNA(mtDNA)是核外唯一的遺傳物質(zhì)，因其特殊的組成結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)定位使mtDNA較nDNA易受損傷、突變率高。同時(shí)，mtDNA幾乎不存在非編碼區(qū)，任何位點(diǎn)的突變部可能被轉(zhuǎn)錄，造成蛋白質(zhì)表達(dá)改變，產(chǎn)生嚴(yán)重后果。
　　RGCs作為一類代謝旺盛的神經(jīng)元，包體和軸突中線粒體的含量非常高。這也就決定了RGC對(duì)線粒體功能異常的敏感性。最近有學(xué)者在青

4、光眼患者外周血中發(fā)現(xiàn)mtDNA突變?cè)黾雍虯TP合成障礙，提示mtDNA損傷及線粒體功能下降是青光眼發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一。然而，這些研究?jī)H局限于患者外周血，還無法解釋青光眼視神經(jīng)病變過程中RGCs和視神經(jīng)進(jìn)行性損傷，甚至在眼壓有效控制后視力損害仍持續(xù)加重的原因。關(guān)于青光眼視神經(jīng)病變發(fā)展過程中，RGCs mtDNA的突變、可能的突變機(jī)制、以及mtDNA突變?cè)诩?xì)胞進(jìn)行性死亡中的作用等問題，未見報(bào)道。
　　為此，本研究以慢性高眼壓Wista

5、r大鼠模型為對(duì)象，研究了mtDNA、mtDNA修復(fù)酶、線粒體復(fù)合物功能在高眼壓和眼壓恢復(fù)正常后的變化，并通過體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)探討了高眼壓mtDNA突變的可能機(jī)制及mtDNA突變與線粒體功能障礙的關(guān)系。此外，還深入探討了mtDNA突變或損傷引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)行性死亡的可能機(jī)制。
　　第一部分慢性高眼壓視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞mtDNA及線粒體功能變化
　　目的:以大鼠慢性高眼壓大鼠模型為研究對(duì)象，系統(tǒng)研究在高眼壓期間和眼壓恢復(fù)正常

6、后RGCs的丟失特征，以及RGCs中mtDNA損傷與突變、mtDNA修復(fù)能力、線粒體功能的動(dòng)態(tài)變化。初步揭示mtDNA異常在青光眼RGCs死亡中的重要性。
　　方法:選用8周齡Wistar大鼠，通過鞏膜上靜脈燒灼(EVC)方法建立慢性高眼壓模型。熒光金逆行標(biāo)記RGCs后視網(wǎng)膜鋪片觀察、計(jì)數(shù)RGCs的存活數(shù)量。SMI32免疫熒光標(biāo)記視神經(jīng)觀察其丟失情況。采用免疫吸附的方法分離純化RGCs后抽提線粒體、mtDNA、nDNA、線粒體蛋白

7、、細(xì)胞漿蛋白、總mRNA。以long-extensionPCR方法檢測(cè)mtDNA損傷、DNA隨即突變捕獲的方法檢測(cè)mtDNA突變率、westernblot和realtime PCR方法檢測(cè)mtDNA修復(fù)酶OGG1、MYH和POLG的表達(dá)、生化方法檢測(cè)線粒體功能，包括線粒體復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ的活性、ATP生成率和ROS含量。
　　結(jié)果:80％術(shù)眼在EVC術(shù)后1天時(shí)眼壓升高，平均值為25.3+1.6 mmHg，在這些眼中高眼壓能持續(xù)至6周者

8、約占35％(18.7±+1.1 mmHg)。術(shù)后6-7周因血管再通導(dǎo)致眼壓逐步降至正常，直至6個(gè)月實(shí)驗(yàn)結(jié)束。對(duì)側(cè)假手術(shù)眼眼壓穩(wěn)定維持在12.16±0.89mmHg。RGCs計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)不僅在高眼壓期間其數(shù)量持續(xù)減少，眼壓恢復(fù)正常后仍進(jìn)行性下降，術(shù)后2、4、6個(gè)月RGCs丟失的比例依次為24.6±0.17％(p＜0.05)、30.4±0.78％(p＜0.01)和34.8±0.15％(p＜0.01)。SMI32陽性染色定量分析也證實(shí)軸突在眼壓恢

9、復(fù)正常后的6周至6月期間繼續(xù)丟失了12％。EVC術(shù)后2周檢測(cè)到mtDNA損傷，并不斷增加，但在高眼壓期間與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。眼壓恢復(fù)正常后繼續(xù)呈進(jìn)行性加重趨勢(shì)，于2、4、6個(gè)月時(shí)檢測(cè)mtDNA損傷分別是對(duì)照組的1.5倍(p＜0.05)、2.8倍(p＜0.01)和3.4倍(p＜0.01)。mtDNA突變隨機(jī)捕獲實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)結(jié)果:眼壓增高后2-4周可檢測(cè)到mtDNA突變?cè)龆啵蹓夯謴?fù)正常后，突變未見減少反而繼續(xù)增加，術(shù)后2、4

10、、6個(gè)月Taq11427位點(diǎn)的突變率分別是對(duì)照組的7.6倍(p＜0.05)、10.3倍(p＜0.01)和16.8倍(p＜0.01);Taq18335位點(diǎn)mtDNA突變率在術(shù)后6周和6月分別是對(duì)照組的9.9倍(p＜0.01)和12.7倍(p＜0.01)。高眼壓后RGCs的mtDNA修復(fù)酶OGG1、MYH和POLG在線粒體內(nèi)表達(dá)下降，即使眼壓恢復(fù)正常仍未見緩解。而mRNA表達(dá)卻表現(xiàn)出與蛋白表達(dá)的不一致，眼壓升高后迅速增多，隨后逐漸下降，但O

11、GG1和MYH始終未降至正常水平以下。高眼壓后RGCs中線粒體復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ的活性與對(duì)照組相比下降，其中復(fù)合物Ⅰ在6周、2、4、6月時(shí)下降36％，(p＜0.05)、39％(p＜0.05)、41％(p＜0.05)和43％(p＜0.05);復(fù)合物Ⅲ下降更明顯，第2周下降35％(p＜0.05)，4月和6月時(shí)分別下降了56％(p＜0.01)和62％(p＜0.01)。術(shù)后6月時(shí)復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ中由mtDNA編碼的亞基cyt B和ND5的蛋白含量仍顯著減

12、少。RGCs內(nèi)線粒體ATP生成率在眼壓升高后出現(xiàn)一過性增高，是對(duì)照組的5.2倍(p＜0.01)，隨即下降，眼壓恢復(fù)正常后仍未改善，至6個(gè)月實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)下降了48％，差異出現(xiàn)顯著性(p＜0.05)，表現(xiàn)為不可逆性減少。ROS在眼壓升高后1周迅速升高，1周時(shí)達(dá)到峰值（為對(duì)照組1.6倍，p＜0.05）。隨后ROS含量快速下降直至正常。術(shù)后4個(gè)月和6個(gè)月時(shí)檢測(cè)到ROS含量再次升高。
　　結(jié)論:高眼壓持續(xù)6周后，即使眼壓恢復(fù)正常，RGCs及其

13、軸突仍呈進(jìn)行性丟失;高眼壓后，RGCs線粒體DNA損傷和突變?cè)黾?，且在眼壓恢?fù)正常后仍進(jìn)行性、累積性加重，伴隨mtDNA修復(fù)能力持續(xù)低下和線粒體功能不可逆性障礙。
　　第二部分壓力對(duì)線粒體DNA損傷及功能影響的體外研究
　　目的:明確壓力是否可以引起mtDNA的損傷和突變，探討mtDNA突變和損傷與線粒體功能障礙的關(guān)系。
　　方法:為在體外模擬慢性高眼壓狀態(tài)，本實(shí)驗(yàn)采用加壓培養(yǎng)大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞，壓力設(shè)定為30mmHg

14、。于加壓后12、24、48、72、96和120小時(shí)收集細(xì)胞，利用long-extension PCR和隨機(jī)突變捕獲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mtDNA的損傷和突變。Real-timePCR和westeren blot方法測(cè)定mtDNA修復(fù)酶OGG1、MYH和POLG的表達(dá)。DCF-DA方法檢測(cè)ROS含量。Lenti-shPOLG轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)mtDNA損傷和突變的細(xì)胞模型，western blot檢測(cè)由mtDNA編碼的線粒體復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ的亞基ND4

15、、ND5、ND6和cyt B的蛋白含量。進(jìn)而采用生化方法檢測(cè)復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ的活性、ATP生成率，JC-1熒光探針測(cè)定線粒體膜電位的變化。
　　結(jié)果:加壓24小時(shí)即可檢測(cè)到mtDNA損傷增加，72小時(shí)較對(duì)照組增加＞40％(p＜0.05)。加壓48小時(shí)后Taq11427位點(diǎn)突變?cè)黾?，是?duì)照組的2.2倍(p＜0.05)，120小時(shí)達(dá)到5.1倍(p＜0.001)。Taq18335位點(diǎn)突變?cè)黾于厔?shì)與Taq11427一致，120小時(shí)達(dá)到對(duì)照組的

16、4.9倍(p＜0.001)。加壓后細(xì)胞ROS含量未見顯著改變。OGG1、MYH和POLG的mRNA表達(dá)在加壓后迅速升高，12小時(shí)達(dá)到峰值，分別是對(duì)照組的11.2倍(p＜0.01)、6.3倍(p＜0.05)和1.8倍(p＜0.05)。隨后OGG1、MYH逐漸恢復(fù)正常直至120小時(shí)，而POLG則持續(xù)下降至正常水平以下。線粒體內(nèi)OGG1、MYH和POLG蛋白表達(dá)在加壓后48小時(shí)開始下降，于72小時(shí)和120小時(shí)分別下降了56％(p＜0.05)、

17、60％(p＜0.01);38％(p＜0.05)、63％(p＜0.01)和39％(p＜0.05)、37％(p＜0.05)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染Lenti-shPOLG后5天和10天，mtDNA損傷較對(duì)照組分別增加了16％(p＞0.05)和46％(p＜0.01)。mtDNA編碼的線粒體復(fù)合物亞基ND5、ND6和cyt B的蛋白表達(dá)顯著下降，與對(duì)照組相比分別下降43％(p＜0.05)、32％(p＜0.05)和34％(p＜0.05)。復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ的活性在轉(zhuǎn)

18、染后10天時(shí)分別下降22.6％(p＜0.05)和40.8％(p＜0.05)，線粒體膜電位下降了63％(p＜0.001)。轉(zhuǎn)染后第9天ATP生成率是對(duì)照組的67.9％(p＜0.05)，顯著減少。
　　結(jié)論:異常升高的壓力可以直接導(dǎo)致mtDNA損傷和突變，一方面直接導(dǎo)致了線粒體功能障礙;另一方面，mtDNA損傷和突變又可造成線粒體膜電位下降，從而引起mtDNA修復(fù)酶表達(dá)下降，三者可形成惡性循環(huán)，最終使mtDNA損傷和突變進(jìn)行性、累積性

19、加重。
　　第三部分 mtDNA損傷和突變加重視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的易損性
　　目的:通過建立RGCs mtDNA損傷和突變的動(dòng)物模型，研究mtDNA損傷和突變?cè)龆嗪驲GCs的凋亡情況，以及對(duì)青光眼常見損傷因素如眼壓升高和谷氨酸濃度增加的敏感性。
　　方法:設(shè)計(jì)三條shPOLG模版DNA，以pSilencer1.0-U6為載體構(gòu)建shPOLG和對(duì)照質(zhì)粒，real-time PCR和westernblot方法檢測(cè)POLG的表

20、達(dá)，篩選出抑制效率最佳的質(zhì)粒并將其克隆到pAAV-CMV-GFP載體中，構(gòu)建AAV2-shPOLG載體、擴(kuò)增、純化。Wistar大鼠玻璃體腔注射AAV2-shPOLG建立RGCs mtDNA損傷和突變模型。注射后2、6、12個(gè)月western blot檢測(cè)RGCs中POLG蛋白表達(dá)、LX-PCR和mt突變隨機(jī)捕獲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mtDNA損傷和突變，DCF-DA法檢測(cè)ROS含量，明確建模是否成功。取注射后12個(gè)月的大鼠視網(wǎng)膜下注射谷氨酸或行鞏膜

21、上靜脈燒灼手術(shù)(EVC)，1周后處死大鼠，進(jìn)行視網(wǎng)膜TUNEL原位檢測(cè)，DiI逆行標(biāo)記RGCs后視網(wǎng)膜鋪片計(jì)數(shù)存活RGCs數(shù)量。Western blot檢測(cè)RGCs中裂解的caspase-3的含量，以明確RGCs的死亡是否屬于凋亡。
　　結(jié)果:AAV2-shPOLG玻璃體腔注射后2、6、12個(gè)月，mtDNA損傷較對(duì)照組增加21％、31％(p＜0.01)和63％(p＜0.01)，Taq11427位點(diǎn)突變率分別是對(duì)照組的6.5倍(p＜

22、0.001)、9.3倍(p＜0.001)和17.1倍(p＜0.001)。RGCs中ROS含量未見顯著改變。TUNEL結(jié)果顯示:rAAV2-shPOLG組中RGCs凋亡數(shù)量是對(duì)照組的2.3倍(p＜0.05); rAAV2-shPOLG聯(lián)合EVC組和rAAV2-shPOLG聯(lián)合谷氨酸組中RGCs凋亡數(shù)量分別較相應(yīng)的對(duì)照組增加了21％(p＜0.05)和35％(p＜0.01)。裂解的caspase-3含量在rAAV2-shPOLG、rAAV2-