EphB-ephrinB反向信號(hào)在慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、青光眼是一類常見的致盲性眼癥，以視神經(jīng)乳頭病變、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少和視野缺失為特征，眼內(nèi)壓增高是其最重要的致病因素之一。青光眼引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷是其導(dǎo)致不可逆性視功能損害的根本原因。目前，臨床治療青光眼的主要手段是降低眼內(nèi)壓，在有效地降低眼內(nèi)壓的基礎(chǔ)上，針對(duì)青光眼具有慢性退行性疾病的特點(diǎn)，利用鈣通道阻斷劑、NMDA受體拮抗劑、抗氧化劑、NO合酶抑制劑和神經(jīng)營養(yǎng)因子等，從不同環(huán)節(jié)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。然而，與其它慢性神經(jīng)退行性疾病相似

2、，青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的確切機(jī)制還不十分清楚。
　　促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體(erythropoietin-producing hepatocyte receptor，Eph)是目前已知最大的受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)家族之一，包含16個(gè)結(jié)構(gòu)上相關(guān)的跨膜酪氨酸激酶。Eph受體及其配體廣泛分布于機(jī)體各種組織，同時(shí)具有廣泛的生理功能，包括調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、細(xì)胞粘附、運(yùn)動(dòng)

3、、細(xì)胞存活、增殖、分化和分泌等。近年來有研究結(jié)果提示，ephrin/Eph信號(hào)在青光眼的進(jìn)程中有著重要作用，且ephrinB反向信號(hào)在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突的瞬時(shí)增加提示其參與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突的損害。但是，其中的機(jī)制目前尚未完全闡明，而且不同的實(shí)驗(yàn)室報(bào)道在不同的青光眼模型中發(fā)生變化的ephrin/Eph亞型也不一樣，這種結(jié)果的不一致性究竟是由于抗體的選擇不同還是實(shí)驗(yàn)對(duì)象種屬不同又或者是所采取的青光眼不同模型對(duì)視網(wǎng)膜或視神經(jīng)損傷程度不同現(xiàn)在也不得而

4、知。
　　在本課題中，我們利用免疫組織化學(xué)、Western blot、免疫共沉淀和膜片鉗電生理等技術(shù)，研究了慢性眼內(nèi)壓增高大鼠視網(wǎng)膜EphB1，EphB2，ephrinB1和ephrinB2的分布及表達(dá)量的變化，以及EphB/ephrinB反向信號(hào)的激活參與慢性眼內(nèi)壓增高大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的可能機(jī)制。主要結(jié)果如下:(1)采用大鼠鞏膜上靜脈結(jié)扎的方法，成功地制備了大鼠慢性高眼壓模型;(2)利用免疫組織化學(xué)和Western bl

5、ot等方法，我們發(fā)現(xiàn)在慢性高眼壓的大鼠視網(wǎng)膜EphB1和ephrinB2蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，而EphB2和ephrinB1沒有顯著變化。EphB1蛋白表達(dá)在手術(shù)后1天(1d)即明顯升高，3d達(dá)到高峰，并且在手術(shù)后1周(1w)至6w都維持在較高水平，增加的部位主要在Müller細(xì)胞上;ephrinB2蛋白表達(dá)在眼內(nèi)壓增高2w明顯增加，在此后我們觀察的6w時(shí)間內(nèi)都維持較高水平，增加的部位在視網(wǎng)膜Müller和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞;而EphB2在神經(jīng)節(jié)細(xì)

6、胞層和內(nèi)核層都有表達(dá)，但在眼內(nèi)壓增高后的各個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)量沒有顯著性變化;ephrinB1在正常視網(wǎng)膜表達(dá)較低，且手術(shù)后表達(dá)沒有明顯的變化。(3)利用特異的ephrinB酪氨酸磷酸化抗體經(jīng)Western blot檢測到ephrinB磷酸化在眼內(nèi)壓增高第3d即開始明顯升高，一直持續(xù)到6w，表明ephrinB反向信號(hào)的激活。(4)為了確認(rèn)慢性眼高壓大鼠視網(wǎng)膜中激活的ephrinB反向信號(hào)的作用，我們在正常大鼠玻璃體內(nèi)注射激活反向信號(hào)的受

7、體可溶性片斷EphB2-Fc，然后檢測視網(wǎng)膜鋪片上神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的TUNEL陽性信號(hào)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與注射空白對(duì)照的片斷相比，EphB2-Fc注射組的TUNEL陽性信號(hào)明顯增多。此結(jié)果提示EphB/ephrinB反向信號(hào)的激活可能參與大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷。(5)在反向信號(hào)引起大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡增多的機(jī)制研究中，利用免疫共沉淀的方法，我們發(fā)現(xiàn)ephrinB2可以與酪氨酸激酶家族中的src和AMPA受體的GluR2亞基相互作用，提示反向

8、信號(hào)的激活可能通過src酪氨酸激酶調(diào)節(jié)GluR2的功能。（6）玻璃體內(nèi)注射EphB2-Fc引起正常大鼠視網(wǎng)膜ephrinB磷酸化增加的同時(shí)，src和GluR2的酪氨酸磷酸化均增強(qiáng)，而且在慢性眼高壓大鼠視網(wǎng)膜也觀察到了src和GluR2的磷酸化也升高。（7）免疫組織化學(xué)和膜蛋白免疫印跡等一列實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GluR2酪氨酸磷酸化的增加使神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膜上GluR2含量下降。EphB2-Fc注射組的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膜上GluR2較對(duì)照組視網(wǎng)膜

9、明顯減少，慢性眼高壓2w的大鼠視網(wǎng)膜上GluR2表現(xiàn)同樣的變化。通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，在EphB2-Fc注射組的視網(wǎng)膜切片上記錄到電刺激誘發(fā)的AMPA受體介導(dǎo)的興奮性突觸后電流(eEPSCs)出現(xiàn)明顯的內(nèi)向整流特性。(8)用src特異性的抑制劑PP2預(yù)先玻璃體注射，隨后再行慢性高眼壓手術(shù)或EphB2-Fc注射，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，PP2在抑制src活性的同時(shí)也抑制了GluR2的酪氨酸磷酸化，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示PP2抑制視

10、網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膜上GluR2含量的下降，更重要的是凋亡檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PP2可以抑制由ephrinB反向信號(hào)激活導(dǎo)致的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡。
　　綜上所述，在我們制作的大鼠慢性高眼壓模型上發(fā)現(xiàn)，EphB1和ephrinB2蛋白表達(dá)在視網(wǎng)膜明顯增多，EphB1的變化主要發(fā)生在Müller細(xì)胞，而ephrinB2在Müller細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上，且EphB1的升高早于ephrinB2，提示神經(jīng)節(jié)細(xì)胞EphB/ephrinB反向信號(hào)的激活。玻

11、璃體內(nèi)注射EphB2-Fc激活EphB/ephrinB反向信號(hào)導(dǎo)致正常大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制是通過src酪氨酸激酶途徑使GluR2磷酸化，進(jìn)而使神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膜上含有GluR2亞單位的AMPA受體數(shù)量減少，鈣通透性增加。而玻璃體內(nèi)注射src酪氨酸激酶抑制劑PP2可以通過抑制GluR2磷酸化，逆轉(zhuǎn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膜上GluR2的減少，從而減弱由注射EphB2-Fc和高眼壓引起的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果提示，EphB/ephrinB反向信