EphB-ephrinB反向信號在慢性高眼壓大鼠視網膜神經節(jié)細胞損傷中的作用及其機制研究.pdf

1、青光眼是一類常見的致盲性眼癥，以視神經乳頭病變、神經節(jié)細胞數目減少和視野缺失為特征，眼內壓增高是其最重要的致病因素之一。青光眼引起的視網膜神經節(jié)細胞損傷是其導致不可逆性視功能損害的根本原因。目前，臨床治療青光眼的主要手段是降低眼內壓，在有效地降低眼內壓的基礎上，針對青光眼具有慢性退行性疾病的特點，利用鈣通道阻斷劑、NMDA受體拮抗劑、抗氧化劑、NO合酶抑制劑和神經營養(yǎng)因子等，從不同環(huán)節(jié)發(fā)揮神經保護作用。然而，與其它慢性神經退行性疾病相似

2、，青光眼視網膜神經節(jié)細胞損傷的確切機制還不十分清楚。
　　促紅細胞生成素產生肝細胞受體(erythropoietin-producing hepatocyte receptor，Eph)是目前已知最大的受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)家族之一，包含16個結構上相關的跨膜酪氨酸激酶。Eph受體及其配體廣泛分布于機體各種組織，同時具有廣泛的生理功能，包括調節(jié)肌動蛋白細胞骨架、細胞粘附、運動

3、、細胞存活、增殖、分化和分泌等。近年來有研究結果提示，ephrin/Eph信號在青光眼的進程中有著重要作用，且ephrinB反向信號在神經節(jié)細胞軸突的瞬時增加提示其參與神經節(jié)細胞軸突的損害。但是，其中的機制目前尚未完全闡明，而且不同的實驗室報道在不同的青光眼模型中發(fā)生變化的ephrin/Eph亞型也不一樣，這種結果的不一致性究竟是由于抗體的選擇不同還是實驗對象種屬不同又或者是所采取的青光眼不同模型對視網膜或視神經損傷程度不同現在也不得而

4、知。
　　在本課題中，我們利用免疫組織化學、Western blot、免疫共沉淀和膜片鉗電生理等技術，研究了慢性眼內壓增高大鼠視網膜EphB1，EphB2，ephrinB1和ephrinB2的分布及表達量的變化，以及EphB/ephrinB反向信號的激活參與慢性眼內壓增高大鼠視網膜神經節(jié)細胞損傷的可能機制。主要結果如下:(1)采用大鼠鞏膜上靜脈結扎的方法，成功地制備了大鼠慢性高眼壓模型;(2)利用免疫組織化學和Western bl

5、ot等方法，我們發(fā)現在慢性高眼壓的大鼠視網膜EphB1和ephrinB2蛋白表達明顯增強，而EphB2和ephrinB1沒有顯著變化。EphB1蛋白表達在手術后1天(1d)即明顯升高，3d達到高峰，并且在手術后1周(1w)至6w都維持在較高水平，增加的部位主要在Müller細胞上;ephrinB2蛋白表達在眼內壓增高2w明顯增加，在此后我們觀察的6w時間內都維持較高水平，增加的部位在視網膜Müller和神經節(jié)細胞;而EphB2在神經節(jié)細

6、胞層和內核層都有表達，但在眼內壓增高后的各個觀察時間點其表達量沒有顯著性變化;ephrinB1在正常視網膜表達較低，且手術后表達沒有明顯的變化。(3)利用特異的ephrinB酪氨酸磷酸化抗體經Western blot檢測到ephrinB磷酸化在眼內壓增高第3d即開始明顯升高，一直持續(xù)到6w，表明ephrinB反向信號的激活。(4)為了確認慢性眼高壓大鼠視網膜中激活的ephrinB反向信號的作用，我們在正常大鼠玻璃體內注射激活反向信號的受

7、體可溶性片斷EphB2-Fc，然后檢測視網膜鋪片上神經節(jié)細胞的TUNEL陽性信號，結果發(fā)現，與注射空白對照的片斷相比，EphB2-Fc注射組的TUNEL陽性信號明顯增多。此結果提示EphB/ephrinB反向信號的激活可能參與大鼠視網膜神經節(jié)細胞的損傷。(5)在反向信號引起大鼠視網膜神經節(jié)細胞凋亡增多的機制研究中，利用免疫共沉淀的方法，我們發(fā)現ephrinB2可以與酪氨酸激酶家族中的src和AMPA受體的GluR2亞基相互作用，提示反向

8、信號的激活可能通過src酪氨酸激酶調節(jié)GluR2的功能。（6）玻璃體內注射EphB2-Fc引起正常大鼠視網膜ephrinB磷酸化增加的同時，src和GluR2的酪氨酸磷酸化均增強，而且在慢性眼高壓大鼠視網膜也觀察到了src和GluR2的磷酸化也升高。（7）免疫組織化學和膜蛋白免疫印跡等一列實驗結果顯示，GluR2酪氨酸磷酸化的增加使神經節(jié)細胞膜上GluR2含量下降。EphB2-Fc注射組的大鼠視網膜神經節(jié)細胞膜上GluR2較對照組視網膜

9、明顯減少，慢性眼高壓2w的大鼠視網膜上GluR2表現同樣的變化。通過全細胞膜片鉗技術，在EphB2-Fc注射組的視網膜切片上記錄到電刺激誘發(fā)的AMPA受體介導的興奮性突觸后電流(eEPSCs)出現明顯的內向整流特性。(8)用src特異性的抑制劑PP2預先玻璃體注射，隨后再行慢性高眼壓手術或EphB2-Fc注射，Western blot檢測發(fā)現，PP2在抑制src活性的同時也抑制了GluR2的酪氨酸磷酸化，免疫組織化學結果顯示PP2抑制視

10、網膜神經節(jié)細胞膜上GluR2含量的下降，更重要的是凋亡檢測結果發(fā)現，PP2可以抑制由ephrinB反向信號激活導致的神經節(jié)細胞的凋亡。
　　綜上所述，在我們制作的大鼠慢性高眼壓模型上發(fā)現，EphB1和ephrinB2蛋白表達在視網膜明顯增多，EphB1的變化主要發(fā)生在Müller細胞，而ephrinB2在Müller細胞和神經節(jié)細胞上，且EphB1的升高早于ephrinB2，提示神經節(jié)細胞EphB/ephrinB反向信號的激活。玻

11、璃體內注射EphB2-Fc激活EphB/ephrinB反向信號導致正常大鼠視網膜神經節(jié)細胞的凋亡，其機制是通過src酪氨酸激酶途徑使GluR2磷酸化，進而使神經節(jié)細胞膜上含有GluR2亞單位的AMPA受體數量減少，鈣通透性增加。而玻璃體內注射src酪氨酸激酶抑制劑PP2可以通過抑制GluR2磷酸化，逆轉神經節(jié)細胞膜上GluR2的減少，從而減弱由注射EphB2-Fc和高眼壓引起的神經節(jié)細胞凋亡。這些結果提示，EphB/ephrinB反向信