慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜Mǔller細胞激活機制的研究.pdf

1、青光眼(glaucoma)是第二大致盲性眼病，眼內(nèi)壓增高是其發(fā)病的重要因素。青光眼所導致的嚴重的不可逆性視功能損害，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷是其基本病理基礎(chǔ)，但關(guān)于青光眼神經(jīng)損害的發(fā)病機制目前尚未完全闡明。近年來，膠質(zhì)細胞的激活(reactivation，gliosis)在神經(jīng)系統(tǒng)損傷和疾病病理過程中的作用日益受到人們的重視，幾乎所有的神經(jīng)系統(tǒng)(包括視網(wǎng)膜)損傷和疾病都伴隨有膠質(zhì)細胞的激活。膠質(zhì)細胞激活，其作用包括兩個方面：一是細胞對損傷所

2、做出的急性反應，通過釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子和抗氧化物質(zhì)，以及攝取胞外集聚的谷氨酸等，從而阻止神經(jīng)元的進一步損傷，促進神經(jīng)軸突的再生和突觸重塑；另一是激活的細胞也可釋放多種細胞毒性因子，這些細胞因子作用于神經(jīng)細胞，誘發(fā)其凋亡或死亡。
　　 Müller細胞是脊椎動物視網(wǎng)膜主要的膠質(zhì)細胞。Müller細胞的激活是許多視網(wǎng)膜疾病共同的改變。Müller細胞激活后，首先表現(xiàn)為膠質(zhì)細胞骨架蛋白包括神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrill

3、ary acidic protein，GFAP)、波形蛋白(vimentin)和巢蛋白(nestin)表達上調(diào)，另一個特征性變化是細胞膜K+電導下調(diào)。然而，青光眼視網(wǎng)膜Mliler細胞的K+通道是否也發(fā)生相同的改變是有待研究的科學問題。并且，Müller細胞在病理狀態(tài)下的激活與K+電流下調(diào)的機制還不清楚。
　　 本課題利用膜片鉗電生理、免疫熒光組織化學和Western blot等技術(shù)，研究了慢性眼內(nèi)壓增高大鼠Müller細胞Ki

4、r(內(nèi)向整流鉀通道)電流的變化，并研究了導致Kir電流變化的可能機制，分析了Kir電流變化和Müller激活之間的關(guān)系。主要的結(jié)果如下：(1)采用燒灼鞏膜上靜脈的方法，成果制備了大鼠慢性高眼壓模型；(2)利用全細胞膜片鉗記錄方法，在急性分離的大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞上記錄到一種弱內(nèi)向整流性質(zhì)的Kir電流；(3)與正常動物的Kir電流相比，在慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜Müller上記錄的Kir電流幅度顯著降低。在我們觀察的眼內(nèi)壓增高后的6 w

5、時間內(nèi)，Kir電流幅度在制模術(shù)后前3 w顯著下降，雖然在第4 w有所恢復，但是直至6 w，Kir電流仍然低于對照組；(4)對Kir電流抑制的機制研究發(fā)現(xiàn)，Kir電流的下調(diào)和Ⅰ型代謝性谷氨酸受體(mGluRⅠ)激活有關(guān)。胞外施加mGluRⅠ的特異性激動劑DHPG，可逆性抑制正常大鼠Müller細胞的Kir電流，其作用可被mGluRⅠ亞型mGluR5的特異性阻斷劑MPEP所拮抗，而mGluRⅠ亞型mGluR1的特異性阻斷劑MPMQ不能阻斷D

6、HPG的作用，說明mGluR5亞型的激活參與Müller細胞Kir電流的下調(diào)；(5)胞內(nèi)信號通路分析發(fā)現(xiàn)，激活mGluRⅠ受體下調(diào)Kir電流和cAMP/PKA(3’，5’-環(huán)腺甘酸/cAMP依賴性蛋白激酶)信號通路無關(guān)，因為forskolin不能誘導Kir電流的改變，cAMP抑制劑Rp-cAMP也不影響DHPG對Kir電流的下調(diào)；同樣，CaMKⅡ也不參與DHPG的作用，CaMKⅡ抑制劑KN62和KN93均不影響DHPG對Kir電流的作用

7、；進一步研究發(fā)現(xiàn)，DHPG對Kir電流的抑制與激活PI-PLC/PKC((磷脂酰肌醇-磷脂酶C/蛋白激酶C))通路有關(guān)。胞內(nèi)透析PI-PLC的特異性阻斷劑U73122可完全阻斷DHPG對Kir電流的壓抑，而PC-PLC(磷脂酰膽堿-磷脂酶C)的抑制劑D609則沒有影響。此外，PKC抑制劑BisⅣ和chelerythrine chloride均可阻斷DHPG對Kir電流的壓抑；(6)IP3和ryanodine介導的胞內(nèi)鈣庫鈣釋放參與了DH

8、PG對Kir電流的調(diào)制。胞內(nèi)透析IP3受體的競爭性阻斷劑heparin可顯著降低DHPG對Kir電流的抑制，但不能完全阻斷；Ryanodine受體特異性激動劑caffeine可使Kir電流幅度緩慢輕度降低，但胞內(nèi)透析高濃度ryanodine耗竭胞內(nèi)ryanodine敏感的鈣庫后，DHPH抑制Kir電流的作用不再出現(xiàn)；此外，用鈣離子螯合劑BAPTA清除胞內(nèi)Ca2+，DHPG也失去對Kir電流的壓抑作用。說明細胞內(nèi)Ca2+-依賴的PI-PL

9、C/IP3-ryanodine/PKC信號通路參與了DHPG對視網(wǎng)膜Müller細胞Kir電流的抑制作用；(7)免疫組織化學和Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在眼內(nèi)壓增高的6 w時間內(nèi)，GFAP的表達隨著時間的延長逐漸增加；Kir4.1在Müller細胞終足上的表達在2 w時有降低，但是到第4 w和第6 w有所恢復；但Western blot對視網(wǎng)膜總Kir4.1表達量的檢測結(jié)果顯示，在制模后表達較制模前有增高，這可能和Kir4.

10、1在視網(wǎng)膜多種細胞上有表達有關(guān)；(8)采用玻璃體腔注射mGluR5拮抗劑MPEP后再行鞏膜上靜脈燒灼制作動物模型，術(shù)后2 w，取材行免疫熒光組織化學染色檢測。與注射生理鹽水對照組相比，注射MPEP組GFAP的表達明顯下降，同時，減弱了Müller細胞Kir4.1表達的下調(diào)；(9)在正常大鼠玻璃體腔注射mGluRⅠ的激動劑DHPG，2 w后取材。免疫熒光組織化學結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與注射生理鹽水的對照組相比，注射DHPG的大鼠Müller細胞GFA

11、P表達顯著增強，而Kir4.1的表達顯著減弱，提示Müller細胞的激活；Western blot的結(jié)果顯示，注射DHPG組的視網(wǎng)膜Kir4.1蛋白含量顯著降低。
　　 綜上所述，在我們制作的大鼠慢性高眼壓大鼠模型上發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜Müller細胞Kir電流顯著降低。伴隨Kir電流的下調(diào)，Müller細胞GFAP蛋白的表達顯著增高，提示Müller細胞的激活。選擇性激活Müller細胞的mGluRⅠ受體可模擬高眼壓所導致的Kir電流

12、抑制，其作用是由細胞膜的mGluR5而非mGluR1受體亞型所介導，而在細胞內(nèi)是由Ca2+依賴的PI-PLC/IP3-ryanodine/PKC信號通路所介導的。玻璃體腔注射mGluR5受體拮抗劑MPEP，可抑制慢性高眼壓模型大鼠Müller細胞GFAP表達，而注射mGluRⅠ激動劑DHPG可誘導正常大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞GFAP表達明顯增高，Kir4.1蛋白表達下調(diào)。這些結(jié)果提示，mGluR5受體介導的Kir電流抑制參與了慢性高眼