大鼠慢性高眼壓模型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的基礎(chǔ)研究.pdf

1、本文通過建立穩(wěn)定的大鼠慢性高眼壓模型，研究青光眼視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞病理改變及其在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷中的作用，并對(duì)青光眼中視網(wǎng)膜大神經(jīng)節(jié)細(xì)胞選擇性損傷機(jī)制進(jìn)行初步探討。 主要研究方法及內(nèi)容 1．用結(jié)扎上鞏膜靜脈聯(lián)合術(shù)后球結(jié)膜下注射5一Fu的方法建立大鼠慢性高眼壓模型。 2．在模型建立后2小時(shí)、12小時(shí)、1天、1周、4周、8周，分別取4只高眼壓組、假手術(shù)組及正常組大鼠眼球，冰凍切片行免疫組織化學(xué)染色，在激光共聚焦顯微鏡

2、下觀察視網(wǎng)膜GFAP表達(dá)的情況。 3．在模型建立后2小時(shí)、12小時(shí)、1天、l周、4周、8周，分別取4只高眼壓組及正常大鼠分別在視網(wǎng)膜鋪片上進(jìn)行GFAP染色，，行星型膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)并觀察其形態(tài)。 4．在模型建立后2小時(shí)、12小時(shí)、1天、1周、4周、8周，分別取4只高眼壓組、假手術(shù)組及正常大鼠鼻側(cè)一半視網(wǎng)膜，在鋪片上行OX42染色，進(jìn)行小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)并觀察其形態(tài)；取剩余的顳側(cè)中周部視網(wǎng)膜，半薄切片行甲苯胺藍(lán)染色進(jìn)行Mailer

3、計(jì)數(shù)。 5．在模型建立后1月，作眼球冰凍切片，行免疫組織化學(xué)染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜TNF-a-GFAP、TNF-a-OX42、TNFR-1-GFAP以及TNFR-1-NeuN的雙標(biāo)染色情況。 6．模型建立后1周、4周，在視網(wǎng)膜鋪片上行免疫組織化學(xué)染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜GluR2以及NF-68的表達(dá)情況。 主要研究結(jié)果 1．結(jié)扎上鞏膜靜脈聯(lián)合術(shù)后球結(jié)膜下注射5-Fu可誘導(dǎo)較長(zhǎng)時(shí)間

4、穩(wěn)定高眼壓，10周內(nèi)130只眼中有112只眼眼壓大于22mmHg，成模率為86．15％；眼壓升高1周、4周、6周、10周后，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活率分別為：90．16％，83．50％，75．01％．62．37％。 2．高眼壓模型建立后2小時(shí)，就有活化的小膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)，一周后活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到高峰，以后逐漸減少。 3．高眼壓模型建立后12小時(shí)，星型膠質(zhì)細(xì)胞以及Miiller細(xì)胞開始呈現(xiàn)活化狀態(tài)，4周后兩者的活化達(dá)到高

5、峰，以后逐漸下降；并且活化的星型膠質(zhì)細(xì)胞在結(jié)構(gòu)上有明顯異常。與正常組相比，慢性高眼壓組視網(wǎng)膜星型膠質(zhì)細(xì)胞以及Miiller的數(shù)量沒有明顯變化。 4．TNF-α、GFAP抗體的免疫組化雙標(biāo)染色：正常大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)界膜下、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的星型膠質(zhì)細(xì)胞GFAP染色呈弱陽(yáng)性，整個(gè)視網(wǎng)膜未見明顯TNF．α陽(yáng)性染色，1個(gè)月高眼壓大鼠除視網(wǎng)膜內(nèi)界膜下、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層星型膠質(zhì)細(xì)胞GFAP染色增強(qiáng)外，其余各層也可見絲條狀貫穿于內(nèi)外界膜之間的GFAP陽(yáng)性

6、染色，其形狀與M(iller細(xì)胞的形狀相似，并且在上述部位有GFAP及TNF．α的共表達(dá)。 5．TNF．a(chǎn)、OX42抗體的免疫組化雙標(biāo)染色：正常大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞有OX42的微弱表達(dá)，胞體小，分支細(xì)、長(zhǎng)，主要分布于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、神經(jīng)纖維層、內(nèi)核層以及內(nèi)叢狀層，整個(gè)視網(wǎng)膜未見TNF-a陽(yáng)性染色；1個(gè)月高眼壓大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞OX42染色變深，胞體變大，分支變粗，但分布仍主要位于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、神經(jīng)纖維層、內(nèi)核層以及內(nèi)

7、叢狀層，并且在上述部位有OX42、TNF．Q的共表達(dá)。 6．TNF-R1、GFAP抗體雙標(biāo)染色：正常大鼠視網(wǎng)膜未見明顯TNF-R1染色；在慢性高眼壓情況下，TNF-R1在視網(wǎng)膜內(nèi)層的表達(dá)較正常對(duì)照組增加，并且在視網(wǎng)膜內(nèi)層，TNF-R1與GFAP有共表達(dá)。 7．TNF-R1、NeuNIgG抗體雙標(biāo)染色：正常大鼠視網(wǎng)膜未見明顯TNF-R染色；同樣，在慢性高眼壓情況下，TNF-R1在視網(wǎng)膜內(nèi)層的表達(dá)較正常對(duì)照組增加，但TNF-

8、R1與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層NeuN(神經(jīng)元特異性核蛋白)沒有共表達(dá)。 8．NF-68免疫組化染色：在正常對(duì)照組及高眼壓組，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層大、中、小直徑的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞均可表達(dá)NF-68，但NF-68在大直徑的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的表達(dá)更為明顯。 9．NF-68及GluR2抗體的免疫組化雙標(biāo)染色：在正常對(duì)照組，大鼠視網(wǎng)膜大神經(jīng)節(jié)細(xì)胞均缺乏GluR2的表達(dá)，而中、小直徑神經(jīng)節(jié)細(xì)胞大都可表達(dá)GluR2；在高眼壓1W以及1M，中、小直徑神經(jīng)節(jié)細(xì)胞

9、GluR2的表達(dá)沒有明顯變化；在高眼壓1W，NF-68陽(yáng)性的大直徑的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞仍缺乏GluR2的表達(dá)；但到高眼壓1M，殘存NF-68陽(yáng)性的大直徑的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞開始表達(dá)GluR2。 結(jié)論 1．結(jié)扎上鞏膜靜脈聯(lián)合術(shù)后球結(jié)膜下注射5-Fu誘導(dǎo)的慢性高眼壓模型具有操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，成模率高，高眼壓可穩(wěn)定維持較長(zhǎng)時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，是較為理想的大鼠慢性高眼壓模型。 2．在慢性高眼壓情況下，視網(wǎng)膜三種膠質(zhì)細(xì)胞(星型膠質(zhì)細(xì)胞、Mail

10、er細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞)均存在活化現(xiàn)象；活化的星型膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞還伴有明顯細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。 3．小膠質(zhì)細(xì)胞可能是視網(wǎng)膜最早發(fā)生病理改變的部位。 4．在慢性高眼壓情況中，活化的視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞(包括星型膠質(zhì)細(xì)胞、Mailer細(xì)胞以及小膠質(zhì)細(xì)胞)TNF-α的表達(dá)明顯增加。 5．在慢性高眼壓情況中，視網(wǎng)膜內(nèi)層膠質(zhì)細(xì)胞TNFR．1表達(dá)增加。 6．正常大鼠視網(wǎng)膜大神經(jīng)節(jié)細(xì)胞均缺乏GIuR2亞單位表達(dá)。