共培養(yǎng)系統(tǒng)中巨噬細(xì)胞對(duì)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活和軸突再生的影響.pdf

1、研究背景：
　　哺乳動(dòng)物的視神經(jīng)和視網(wǎng)膜是腦的衍生物，屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）。視神經(jīng)纖維由視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cells，RGCs）的軸突構(gòu)成。在視神經(jīng)損傷后，RGCs發(fā)生不可逆行性退變與、凋亡，,是導(dǎo)致視功能不可逆性損害的主要原因，也是在臨床中青光眼、視網(wǎng)膜缺血性疾病等眼科疾病的主要損傷細(xì)胞。由此常造成嚴(yán)重的視力損害，臨床上的治療十分棘手。近年來(lái)視

2、神經(jīng)的保護(hù)和再生成為困擾醫(yī)學(xué)界的世界性難題，對(duì)視神經(jīng)再生各方面的研究也是眾說(shuō)紛紜。周圍神經(jīng)系統(tǒng)（peripheral nerveous system，PNS）和CNS損傷后都將發(fā)生一系列形態(tài)學(xué)變化：損傷遠(yuǎn)端軸突發(fā)生潰變，近端軸突少量潰變后長(zhǎng)出神經(jīng)芽突，同時(shí)受損區(qū)域周圍膠質(zhì)細(xì)胞增生。但是CNS和PNS不同，軸突發(fā)芽后不繼續(xù)生長(zhǎng)并且很快夭折。發(fā)生這種變化的一個(gè)主要原因是CNS和PNS的微環(huán)境不同，它們的髓鞘細(xì)胞類型不同，PNS的髓鞘是雪旺細(xì)

3、胞（Schwann cell），而CNS是少突膠質(zhì)細(xì)胞（oligodendroglia）。雪旺細(xì)胞可產(chǎn)生多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，能促進(jìn)PNS軸突再生，少突膠質(zhì)細(xì)胞則產(chǎn)生神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子，不利于CNS軸突的再生。
　　近年來(lái)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在晶狀體損傷后，可以在視神經(jīng)損傷后促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突再生。而晶狀體損傷后可以引起眼內(nèi)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，這提示巨噬細(xì)胞可能在視神經(jīng)損傷后RGC存活和軸突再生中扮演重要角色。
　　因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分

4、別對(duì)新生大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及成年大鼠腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，利用Transwell小室建立兩種細(xì)胞的共培養(yǎng)模型；觀察巨噬細(xì)胞對(duì)RGC存活時(shí)間及軸突再生的影響。
　　目的：
　　分別對(duì)成年SD大鼠腹腔巨噬細(xì)胞和新生SD大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)行的原代培養(yǎng)、純化及鑒定；建立巨噬細(xì)胞/RGC的共培養(yǎng)模型，觀察巨噬細(xì)胞對(duì)RGC存活時(shí)間及軸突再生長(zhǎng)度的影響。
　　方法：
　　1.大鼠腹膜腔注射DMEM培養(yǎng)液約6mL，按摩

5、腹腔10分鐘后,用生理鹽水10mL灌洗腹膜腔。抽取腹膜腔細(xì)胞懸液，離心2次(1000r·min-1，5min)。加DMEM培養(yǎng)液混懸細(xì)胞，37℃培養(yǎng)2h后，D-Hanks液洗除漂浮的淋巴細(xì)胞，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。兔抗大鼠CD68單克隆抗體免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行鑒定。
　　2.取出生1dSD仔鼠，斷頭處死后，在無(wú)菌條件下取眼球，解剖顯微鏡下去除眼前段，鈍性分離視網(wǎng)膜，加入0.125％胰蛋白酶消化，37℃條件下放置20min后，500r·m

6、in-1離心3分鐘，漂洗2次，去除上清液。加入培養(yǎng)液（含2％B27，15μg/mLBRDU的DMEM），鈍頭吸管吹打成單細(xì)胞懸液，行細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種于24孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。兔抗大鼠GAP-43單克隆抗體免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行鑒定。
　　3.采用transwell小室建立大鼠腹膜腔巨噬細(xì)胞和RGCs的共培養(yǎng)模型，不用巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的RGCs作為對(duì)照組，用胎盤藍(lán)染色計(jì)數(shù)及相差顯微鏡觀察RGCs存活的時(shí)間，并測(cè)量培養(yǎng)1d、3d和5d時(shí)R

7、GCs突起的平均長(zhǎng)度，進(jìn)行組間比較。
　　結(jié)果：
　　成功獲取并培養(yǎng)了大鼠巨噬細(xì)胞和RGCs,建立了兩種細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)。1d、3d、5d和7d，共培養(yǎng)組平均RGCs活細(xì)胞數(shù)分別為（35.50±2.92）、（28.20±3.36）、（18.70±3.95）和（8.80±1.55），與對(duì)照組（36.20±2.35）、（27.10±2.96）、（15.80±3.04）和（8.40±2.01）比較，兩組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（P