全反式視黃酸誘導新生大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)前體細胞向光感受器細胞分化的研究.pdf

1、目的：探討全反式視黃酸（all-trans retinoic acid，ATRA）誘導新生大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)前體細胞（neural retinal progenitor cell，NRPC）向光感受器細胞分化的作用。 方法：從新生Sprague-Dawley大鼠（出生后第一天，day1 postnatal，P1）視網(wǎng)膜分離并擴增視網(wǎng)膜神經(jīng)前體細胞（retinal progenitor cells，RPC），在含968μl/m1N2、

2、10μl/m1827、20ng/ml表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、20ng/ml堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、2μg/ml肝素及1％青鏈霉素的無血清DMEM/F12完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)和傳代。取第3代視網(wǎng)膜神經(jīng)前體細胞作為研究對象，隨機分為三組：①RPC對照組：繼續(xù)原完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；②胎牛血清誘導組：在原完全培養(yǎng)基中去除EGF、bFGF

3、和肝素并加入10％胎牛血清；③全反式視黃酸（ATRA）誘導組：在原完全培養(yǎng)基中去除EGF、bFGF和肝素并加入1％胎牛血清及0.5μmol/L全反式視黃酸誘導分化。孵育七天后觀察細胞形態(tài)變化，采用免疫細胞化學法檢測神經(jīng)干/前體細胞的標記物巢蛋白Nestin、神經(jīng)膠質(zhì)細胞的標記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、神經(jīng)元標記物β-微管蛋白（β-Tubulin）、光感受器細胞不同發(fā)育

4、階段的標記物視錐-視桿細胞同源異型基因（cone-rod homeobox gene，CRX）、恢復蛋白Recoverin及視紫紅質(zhì)Rhodopsin的表達，分別比較三組間各種標記物表達的陽性率。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（reverse-transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測三組細胞中成對同源異形盒轉(zhuǎn)錄因子6（paired box6，Pax6）mRNA的表達含量，分析全反式視黃

5、酸對視網(wǎng)膜神經(jīng)前體細胞向光感受器細胞分化的誘導效應(yīng)。 結(jié)果： 1.視網(wǎng)膜神經(jīng)前體細胞誘導分化后的免疫熒光鑒定結(jié)果： ①對照組：在未經(jīng)誘導的對照組，細胞多呈集落生長，少部分單個貼壁，形態(tài)以橢圓形或三角形為主，有兩到三個短的突起，胞核較大，呈圓形，胞質(zhì)較少，79.5％細胞為Nestin陽性表達細胞，即神經(jīng)前體細胞；GFAP、β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin陽性表達細胞百分比分別為15

6、.8％、13.4％、10.9％、10.1％和8.9％。 ②胎牛血清誘導組：視網(wǎng)膜神經(jīng)前體細胞經(jīng)10％FBS誘導7天后，光鏡下見細胞呈單個貼壁生長，部分細胞胞體扁平，形態(tài)不規(guī)則，似膠質(zhì)細胞。部分細胞伸出一個或多個突起，突起與突起相接觸。Nestin陽性表達細胞數(shù)目明顯減少，而GFAP陽性表達細胞數(shù)目顯著增加，β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin陽性表達的細胞數(shù)量明顯增加，有顯著差異（P<0.05）。其

7、中Nestin、GFAP、β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin陽性表達細胞百分比分別為16.0％、70.9％、21.2％、18.8％、18.7％和17.9％。 ③ATRA誘導組：視網(wǎng)膜神經(jīng)前體細胞經(jīng)0.5μM全反式視黃酸誘導7天后，細胞呈單個貼壁生長，部分細胞伸出一個或兩個較長突起，突起間互相接觸。β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin陽性表達的細胞數(shù)量明顯增加，有顯著性

8、差異（P<0.05）。Nestin、GFAP、β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin陽性表達細胞百分比分別為14.1％、23.2％、64.7％、61.2％、59.2％和55.4％。 對照組大部分細胞仍然表達nestin，而胎牛血清組和ATRA組nestin陽性表達細胞數(shù)量顯著減少（P<0.05）；胎牛血清組GFAP陽性表達細胞數(shù)量顯著增多（P<0.05），是對照組的4.49倍；ATRA組早期神經(jīng)元β-

9、Tubulin陽性細胞明顯增多（P<0.05），是對照組的4.83倍。ATRA組的光感受器標記CRX、Recoverin及Rhodopsin陽性表達細胞分別為對照組的5.61、5.86和6.22倍。 2.PAX6 mRNA的表達：視網(wǎng)膜神經(jīng)前體細胞誘導分化后，凝膠電泳圖分析檢測發(fā)現(xiàn)：ATRA誘導組PAX6表達量最少，胎牛血清組其次，對照組Pax6表達量最多。 結(jié)論： 0.5μM全反式視黃酸在體外能有效誘導新生SD