骨髓間充質干細胞體外誘導分化為光感受器樣細胞的蛋白質組學研究.pdf

1、間充質干細胞（MesenchymAlStem Cells， MSCs）是一多能干細胞，具有定向誘導分化為多種組織的潛力。最近研究表明誘導后的MSCs可表達視網(wǎng)膜光感受器細胞特異性標志物。因此，研究MSCs定向誘導分化為光感受器樣細胞為干細胞移植治療視網(wǎng)膜變性疾病奠定基礎。目前，對MSCs的特征及其誘導分化為光感受器樣細胞的蛋白調(diào)控機制還不清楚。本研究模擬視網(wǎng)膜體內(nèi)生存的微環(huán)境，將人骨髓間充質干細胞（Bone MesenchymAlSte

2、m Cells，BMSCs）誘導分化成視網(wǎng)膜光感受器樣細胞，建立BMSCs誘導分化為光感受器樣細胞的差異蛋白質庫，探討B(tài)MSCs誘導分化為光感受器樣細胞的分化標記和蛋白質調(diào)控機制。
　　
　　 第一部分骨髓間充質干細胞體外誘導分化為光感受器樣細胞
　　 目的：研究BMSCs在體外定向分化為光感受器樣細胞及光感受器細胞特異性標志物視紫紅質、恢復蛋白的表達情況。
　　 方法：取第2～4代的人BMSCs細胞株

3、及第3代RPE細胞株進行實驗。實驗分兩組：誘導組和對照組。誘導組：BMSCs與20ng/mlbFGF、20ng/mlEGF及20ng/mlBDNF的MSCM及RPE細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。對照組：單純使用配制好的MSCM培養(yǎng)。應用免疫細胞化學檢測不同誘導時間（3d、5d、7d）視紫紅質蛋白的陽性表達率。 Realtime-PCR方法檢測誘導7d后細胞視紫紅質、恢復蛋白mRNA的表達情況。
　　 結果：免疫細胞化學方法檢測第3d即有視紫紅

4、質表達，第7d視紫紅質陽性率為（29.8±2.3)％，對照組均未檢測到視紫紅質表達。誘導組均較對照組有顯著性差異，p<0．01。在誘導7d后采用Realtime-PCR方法檢測到誘導細胞有視紫紅質、恢復蛋白mRNA的表達，對照組未見視紫紅質、恢復蛋白mRNA表達。
　　 結論：本研究證實采用含有細胞因子的培養(yǎng)液及RPE細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，BMSCs在體外能夠誘導分化成光感受器樣細胞，表達其特異性標志物視紫紅質、恢復蛋白。
　　

5、 第二部分骨髓間充質干細胞體外誘導分化為光感受器樣細胞的蛋白質組學研究
　　 目的：研究體外BMSCs向光感受器樣細胞分化過程中的差異蛋白質，探討B(tài)MSCs定向分化的標記和蛋白調(diào)控機制。
　　 方法：取第4～6代的人BMSCs細胞株進行實驗。細胞培養(yǎng)誘導分化同前。實驗分兩組：MSCs組和誘導組（誘導后7d的細胞）。通過2D-DIGE雙向電泳技術及MALDI-TOF-MS分析，共鑒定出32個差異表達蛋白。Western-

6、blot進一步驗證了Zyxin、β-tropomyosin的差異表達。
　　 結果：共鑒定出32個差異表達蛋白，其中11個蛋白質表達上調(diào)，21個蛋白質表達下調(diào)，建立了BMSCs向光感受器樣細胞誘導分化7d后的差異表達蛋白譜。鑒定出的蛋白質分為7類：細胞骨架蛋白、分子伴侶、能量代謝的激酶、信號轉導通路相關蛋白、細胞增殖、分化和凋亡相關蛋白、鈣結合蛋白和離子通道及其他蛋白。研究發(fā)現(xiàn)β-tropomyosin、p38、人類增殖細胞核抗