體外誘導(dǎo)大鼠脂肪干細(xì)胞向光感受器細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分化的初步研究.pdf

1、第一部分：大鼠脂肪干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。 目的：分離、培養(yǎng)和鑒定大鼠的脂肪干細(xì)胞。 方法：Ⅰ型膠原酶分離大鼠脂肪干細(xì)胞，用貼壁篩選法，在含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過(guò)連續(xù)傳代使細(xì)胞純化后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD45、CD90、CD49d、CD106鑒定干細(xì)胞的表面抗原。 結(jié)果：上述方法可以獲得大量高純度的脂肪干細(xì)胞。原代脂肪干細(xì)胞表型檢測(cè)：CD45陽(yáng)性率是1.6％，CD90是71.3％，C

2、D49d是7.8％，CD106是3.5％。從傳1代至傳5代，CD45陽(yáng)性率是0.8％～9.3％，CD90是84.7％～94.8％，CD49d是16.8％～31.0％，CD106是3.5％。各代ADSCs中，CD49d的陽(yáng)性率均高于CD106。 第二部分：大鼠脂肪干細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)向光感受器細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的分化。 目的：體外誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向光感受器細(xì)胞和RPE細(xì)胞的分化，并對(duì)不同誘導(dǎo)條件進(jìn)行比較。。 方法：

3、采用機(jī)械分離法獲得視網(wǎng)膜感覺神經(jīng)上皮細(xì)胞，以及Dispase消化法獲得RPE細(xì)胞，制備視網(wǎng)膜細(xì)胞提取液。用EGF、激活素A、?；撬帷⒁朁S酸和視網(wǎng)膜細(xì)胞提取液?jiǎn)为?dú)誘導(dǎo)大鼠脂肪干細(xì)胞；用EGF+牛磺酸、EGF+視黃酸、?；撬?視黃酸、EGF+?；撬?視黃酸聯(lián)合誘導(dǎo)大鼠脂肪干細(xì)胞。用免疫熒光法和流式細(xì)胞儀鑒定被誘導(dǎo)的細(xì)胞的視紫紅質(zhì)、CK和S—100的表達(dá)。免疫熒光法顯示脂肪干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)視紫紅質(zhì)、CK和S—100。流式細(xì)胞儀檢測(cè)

4、對(duì)照組和各種誘導(dǎo)組的視紫紅質(zhì)、CK和S—100的表達(dá)，并計(jì)算誘導(dǎo)效應(yīng)。 結(jié)果：視網(wǎng)膜細(xì)胞提取液誘導(dǎo)的部分細(xì)胞，呈卵圓形或梭形，細(xì)胞內(nèi)可見色素。在含有誘導(dǎo)劑的1％FBS/αMEM中，細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢，細(xì)胞呈扁平多角形。脂肪干細(xì)胞的視紫紅質(zhì)的誘導(dǎo)效應(yīng)是17.5％～46.0％，CK的誘導(dǎo)效應(yīng)是19.7％～79.3％，S—100的誘導(dǎo)效應(yīng)是27.3％～50.7％。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的視紫紅質(zhì)的誘導(dǎo)效應(yīng)是55.9％～76.5％，CK的誘導(dǎo)效

5、應(yīng)是39.4％～75.9％，S—100的誘導(dǎo)效應(yīng)是25.4％～41.8％。 結(jié)論：改良的原代ADSCs分離和培養(yǎng)方法，可以獲得更多的細(xì)胞。采用貼壁篩選法，獲得高純度的ADSCs。采用機(jī)械分離法獲得視網(wǎng)膜感覺神經(jīng)上皮細(xì)胞，以及Dispase消化法獲得RPE細(xì)胞，可以制備全層視網(wǎng)膜細(xì)胞提取液，用于ADSCs誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。用EGF、激活素A、?；撬帷⒁朁S酸和視網(wǎng)膜細(xì)胞提取液?jiǎn)为?dú)誘導(dǎo)；用EGF+?；撬帷GF+視黃酸、?；撬?視黃酸、EGF