新生大鼠腦干耳蝸核存在神經(jīng)前體細胞的初步證據(jù).pdf

1、感音神經(jīng)性聾是臨床常見病和多發(fā)病，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，臨床上尚無理想的治療方法。目前關(guān)于感音神經(jīng)性聾的防治研究已成為聽力學和耳科學研究的熱點和難點之一。近年來，運用胚胎或神經(jīng)干細胞（neuralstemcells，NSCs）以及（neuralprogenitorcells，NPCs）的替代治療應運而生，并受到密切的關(guān)注。目前大量的研究致力于干細胞/前體細胞移植促進聽覺功能恢復，研究方向主要集中于外源性NSCs的直接或定向誘導后移植，

2、或者將NSCs作為外源性基因的載體進行移植。雖然國內(nèi)外學者在此方面已經(jīng)進行了很多工作，取得了一定的進展，但仍有很多難題亟待解決。其關(guān)鍵問題之一是：對于NSCs/NPCs在聽功能的形成與發(fā)育過程中的作用，尤其是聽覺中樞神經(jīng)核團內(nèi)是否存在多向分化潛能的NSCs/NPCs還不甚清楚。
　　實驗一：新生大鼠腦干耳蝸核神經(jīng)前體細胞的分離、培養(yǎng)
　　目的：目前聽覺系統(tǒng)是否存在NSCs/NPCs的研究主要集中在內(nèi)耳感受神經(jīng)元的干細胞/前體

3、細胞上，近年研究證實哺乳動物內(nèi)耳中存在著一定數(shù)量毛細胞的前體細胞，而聽覺中樞神經(jīng)核團內(nèi)是否存在多向分化潛能的NSCs/NPCs目前尚未見報道。本研究擬分離、培養(yǎng)新生大鼠腦干耳蝸核NPCs，觀察其增殖及傳代特性，建立新生大鼠腦干耳蝸核NPCs的培養(yǎng)方法，為進一步研究打下基礎。方法：P1、P3、P5、P7、P9、P11以及成年SD成年大鼠麻醉后，75％酒精消毒，無菌條件下開顱切取腦干耳蝸核，經(jīng)剪碎、消化、離心、洗滌、吹打、過濾、計數(shù)，接種于

4、無血清培養(yǎng)液DMEM/F12(11)∶培養(yǎng)，內(nèi)含B27(150)∶、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、20ng/mlEGF、20ng/mlbFGF，置于5％CO2培養(yǎng)箱(37℃)內(nèi)培養(yǎng)。細胞每5～7d傳代1次。取次代神經(jīng)球離心后消化，吹打成單細胞懸液，通過“有限稀釋法”獲得從一個單細胞克隆擴增出的大量均質(zhì)的腦干耳蝸核“神經(jīng)前體細胞”。采取免疫熒光、免疫組織化學的方法，對NSCs/NPCs的特異性標記物Nestin、Musas

5、hi1的表達進行鑒定；通過臺盼藍染色技術(shù)檢測不同日齡組細胞活力；CCK-8法繪制不同日齡組生長曲線，觀察不同生長因子對于細胞增殖的影響。結(jié)果：新生5-7日齡大鼠腦干耳蝸核可以分離培養(yǎng)“神經(jīng)前體細胞”，體外培養(yǎng)可以形成神經(jīng)球，并保持旺盛的增殖活力，可持續(xù)傳代100代以上；這些細胞經(jīng)稀釋純化、傳代后可以繼續(xù)形成細胞克隆。細胞克隆呈nestin、musashil1免疫反應陽性；5-7日齡大鼠腦干耳蝸核中“神經(jīng)前體細胞”數(shù)量較多，增殖能力旺盛，

6、而在小于5日齡與大于9日齡大鼠中該細胞數(shù)量很少，而且增殖能力差，很難連續(xù)傳代。表皮生長因子（EGF）和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）聯(lián)合應用可以明顯促進耳蝸核中的“神經(jīng)前體細胞”的傳代、增殖。結(jié)論：從新生5-7日齡大鼠腦干耳蝸核可以分離、培養(yǎng)出具有長期自我更新、維持自身數(shù)量穩(wěn)定、保持未分化狀態(tài)進行傳代分裂增殖的具有部分NSCs特性的“神經(jīng)前體細胞”。
　　實驗二：新生大鼠腦干耳蝸核神經(jīng)前體細胞體外分化特性的對比研究
　　

7、目的：在實驗一中，我們在新生5-7日大鼠的腦干耳蝸核中分離出了具有體外連續(xù)傳代增殖能力的“神經(jīng)前體細胞”，這些細胞體外培養(yǎng)可以形成神經(jīng)球，并表達NSCs/NPCs的特異性抗體，但還沒有證實其是否存在NSCs/NPCs的另一個重要的特性——多向分化潛能。本實驗擬通過免疫組織化學、免疫熒光、分子生物學的方法，驗證該細胞的體外多向分化能力，觀察分析其分化特性，并比較其與嗅球NSCs、嗅上皮NSCs分化特性的差異。方法：三種細胞分別取材培養(yǎng)，進

8、行體外誘導分化后免疫細胞化學、免疫熒光化學以及分子生物學的鑒定；進行細胞的BrdU的體外標記，觀察增殖與分化情況。結(jié)果：我們的實驗結(jié)果提示大部分細胞分化為NeuN免疫反應陽性的神經(jīng)元和GFAP免疫反應陽性的星形膠質(zhì)細胞，少部分細胞分化為GalC免疫反應陽性的少突膠質(zhì)細胞；標記后大部分細胞均為BrdU陽性，表明其處于增殖期，通過對三種來源細胞BrdU陽性率的比較可以發(fā)現(xiàn)，嗅球來源與耳蝸核來源的細胞BrdU的陽性率相近，均高于嗅上皮來源的N

9、SCs。這可能由于不同腦區(qū)的發(fā)育特性導致其干細胞增殖能力不同。結(jié)論：新生大鼠腦干耳蝸核中的這種“神經(jīng)前體細胞”具有了體外多向分化的潛能。
　　實驗三：新生大鼠腦干耳蝸核神經(jīng)前體細胞的超微結(jié)構(gòu)研究
　　目的：了解大鼠腦干耳蝸核“神經(jīng)前體細胞”的超微結(jié)構(gòu)、細胞之間的聯(lián)系以及細胞的增殖和發(fā)育狀態(tài)，有助于闡明該細胞在體外培養(yǎng)條件下的生長、發(fā)育和分化等生物學行為，為該細胞的研究和應用奠定基礎。方法：本研究在成功分離、培養(yǎng)新生大鼠腦干耳

10、蝸核“神經(jīng)前體細胞”的基礎上，應用掃描及透射電子顯微鏡觀察新生大鼠腦干耳蝸核“神經(jīng)前體細胞”的超微結(jié)構(gòu)，進一步研究新生大鼠腦干耳蝸核“神經(jīng)前體細胞”的生物學特征，以期為更深層次的研究和應用提供依據(jù)。結(jié)果：體外培養(yǎng)的NSCs呈圓形或橢圓形，表面有微突起或微絨毛，細胞核漿比例高，稀少的細胞漿中有多少不等的未成熟線粒體、核糖體及高爾基復合體。不同培養(yǎng)時期的神經(jīng)球內(nèi)未分化NSCs的結(jié)構(gòu)大致相同，均有分裂增殖細胞及少數(shù)凋亡細胞。分化后細胞伸出樹突

11、、軸突樣結(jié)構(gòu)，相鄰細胞之間有突觸樣組織。結(jié)論：電鏡提示耳蝸核“神經(jīng)前體細胞”具有原始細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，分化后的細胞均有神經(jīng)細胞的形態(tài)學特點。
　　實驗四大鼠腦干耳蝸核神經(jīng)前體細胞的凍存與復蘇
　　目的：NSCs在神經(jīng)組織中含量少，獲取大量純化NSCs是研究工作的基礎。NSCs在體外的合理凍存與復蘇及無損保存是NSCs研究的關(guān)鍵。建立一種能夠長期儲存并維持NSCs生物學特性的方法對促進神經(jīng)科學的基礎和臨床移植的研究具有重要的意

12、義。方法：我們應用不同凍存保護液對新生大鼠腦干耳蝸核“神經(jīng)前體細胞”進行凍存，研究低溫凍存對該細胞的增殖及多向分化潛能的影響，并以胚胎大鼠嗅球神經(jīng)干細胞作為對照進行研究，分析凍存與復蘇對于新生大鼠腦干耳蝸核“神經(jīng)前體細胞”生物學特性的影響。結(jié)果：采取正確的凍存與復蘇方法，對新生大鼠腦干耳蝸核“神經(jīng)前體細胞”的生物學特性無影響。結(jié)論：新生大鼠腦干耳蝸核“神經(jīng)前體細胞”經(jīng)低溫長期凍存，復蘇后對于該細胞的基本生物學特性沒有明顯影響，可以長期低