新生大鼠耳蝸高增殖細(xì)胞的研究及新霉素對(duì)耳蝸nestin表達(dá)的影響.pdf

1、第一部分新生大鼠耳蝸高增殖細(xì)胞的研究 目的：L研究新生大鼠耳蝸內(nèi)是否有高增殖細(xì)胞，以及該高增殖細(xì)胞能夠分化為哪些類型的細(xì)胞。同時(shí)探討纖維粘連蛋白，多聚鳥氨酸及多聚賴氨酸對(duì)高增殖細(xì)胞球貼壁及生長(zhǎng)的影響。2．觀察堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)對(duì)耳蝸高增殖細(xì)胞的影響。3．觀察耳蝸高增殖細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。以期為利用耳蝸高增殖細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞移植治療感音神經(jīng)性耳聾提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：L分離Pl～3sD大鼠耳

2、蝸基底膜，制成單細(xì)胞懸液，在無(wú)血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)，形成細(xì)胞球后，接種于不同基質(zhì)(纖維粘連蛋白，多聚鳥氨酸及多聚賴氨酸)包被的蓋玻片上貼壁分化，觀察細(xì)胞球的貼壁及生長(zhǎng)情況，同時(shí)對(duì)貼壁16小時(shí)的細(xì)胞球計(jì)數(shù)，數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過(guò)BrdU摻入實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞的增殖狀態(tài)；通過(guò)免疫組化熒光染色方法，鑒定細(xì)胞球及其分化細(xì)胞的性質(zhì)。2．在無(wú)血清培養(yǎng)液中添加EGF或／和bFGF，培養(yǎng)7天后，進(jìn)行細(xì)胞球計(jì)數(shù)，比較二種生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞球生長(zhǎng)的影響。3．對(duì)細(xì)胞球

3、及貼壁分化細(xì)胞進(jìn)行透射和掃描電鏡觀察，了解其超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：1.在上述條件下培養(yǎng)的細(xì)胞不斷分裂增殖，形成懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞球，細(xì)胞球內(nèi)90％細(xì)胞呈5-溴-2-脫氧尿嘧啶(5-bromo-2-demoxyuridine，BrdU)染色陽(yáng)性，并且球內(nèi)細(xì)胞巢蛋白(nestin)染色陽(yáng)性；對(duì)細(xì)胞球貼壁后分化的細(xì)胞行免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色鑒定，可見(jiàn)①肌球蛋白7A(myosin7A)、espin、myosin7A+鬼筆環(huán)肽(phalloidin

4、)、myosin7A+BrdU，espin+BrdU陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞，表現(xiàn)為毛細(xì)胞的特征；②神經(jīng)絲蛋白-M(neurofilament-M，NF-M)、微管蛋白-β-Ⅲ(tubulin-β-Ⅲ)、nestin以及NF-M+BrdU陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞，表現(xiàn)為神經(jīng)元特征：③膠質(zhì)纖維酸性蛋白(G1ialFibrillaryAcidicProtein，GFAP)陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞，表現(xiàn)為支持細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征。2．在纖維粘連蛋白、多聚鳥氨酸及多聚賴

5、氨酸包被的玻片上，每張玻片平均貼壁的細(xì)胞數(shù)分別為：44.12±8．04，11±2．10，7．33±1.51。纖維粘連蛋白與多聚鳥氨酸和多聚賴氨酸之間的差異極為顯著，而多聚鳥氨酸與多聚賴氨酸之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3．單個(gè)耳蝸平均可培養(yǎng)出45．25±22．95個(gè)細(xì)胞球，培養(yǎng)液中添加bFGF或/和EGF可以明顯增加細(xì)胞球的數(shù)量，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4．掃描電鏡顯示細(xì)胞球內(nèi)細(xì)胞呈圓球形，大小均勻一致，表面具有眾多短而細(xì)的微絨毛樣突起，無(wú)數(shù)球形的

6、細(xì)胞彼此黏附在一起；透射電鏡顯示細(xì)胞球內(nèi)細(xì)胞排列緊密，之間可見(jiàn)緊密連接、橋粒和縫隙連接，細(xì)胞體積小，胞核大。細(xì)胞球內(nèi)細(xì)胞表面具有眾多的微絨毛樣結(jié)構(gòu)，胞漿內(nèi)有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、微管、微絲和線粒體等細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器。貼壁分化細(xì)胞掃描電鏡顯示細(xì)胞表面具有眾多短而細(xì)的微絨毛樣突起。 結(jié)論：L新生SD大鼠耳蝸內(nèi)存在一種具有高增殖能力的細(xì)胞，可以分化為具有纖毛樣結(jié)構(gòu)的毛細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或支持細(xì)胞。2．纖維粘連蛋白有利于高增殖細(xì)胞球

7、的貼壁與生長(zhǎng)。3．平均單個(gè)新生SD大鼠耳蝸可培養(yǎng)出45．25±22．95個(gè)高增殖細(xì)胞球。EGF或／和bFGF均可誘導(dǎo)耳蝸內(nèi)高增殖細(xì)胞形成細(xì)胞球。3．耳蝸高增殖細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)顯示早期幼稚細(xì)胞發(fā)育的特征。 第二部分新霉素對(duì)大鼠耳蝸nestin表達(dá)的影響 目的：研究nestin在正常及新霉素致?lián)p大鼠耳蝸感覺(jué)上皮細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元表達(dá)的變化，以期了解新霉素對(duì)大鼠耳蝸nestin表達(dá)的影響。 方法：1.取正常不同年齡(

8、P1、P14、P30、P60)的sD大鼠耳蝸行免疫組化染色，觀察耳蝸各圈感覺(jué)上皮及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元nestin表達(dá)的變化；2．12只7天齡SD大鼠隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組：實(shí)驗(yàn)組連續(xù)皮下注射新霉素共12天，對(duì)照組注射等量的生理鹽水，分別于停藥后的第1天和第14天，處死動(dòng)物，取出耳蝸，進(jìn)行免疫組化熒光染色，觀察耳蝸各圈感覺(jué)上皮及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元nestin與GFAP表達(dá)的變化。 結(jié)果：1．在正常P1大鼠耳蝸之感覺(jué)上皮可見(jiàn)nestin

9、陽(yáng)性表達(dá)，項(xiàng)圈細(xì)胞表達(dá)nestin免疫反應(yīng)最強(qiáng)，其次為中圈，底圈最弱；不僅支持細(xì)胞表達(dá)nestin，而且內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞也表達(dá)nestin；在P30大鼠，感覺(jué)上皮細(xì)胞表達(dá)nestin明顯減弱，至P60大鼠，感覺(jué)上皮細(xì)胞nestin的表達(dá)消失。2．在正常P1及P14大鼠，耳蝸各圈螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元表達(dá)nestin陽(yáng)性，其中項(xiàng)圈表達(dá)nestin免疫反應(yīng)最強(qiáng)，在P30大鼠，各圈螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元表達(dá)nestin減弱，但在P60大鼠，仍可見(jiàn)螺旋神

10、經(jīng)節(jié)神經(jīng)元表達(dá)nestin。3．與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組耳蝸感覺(jué)上皮細(xì)胞在停藥后第1天，nestin的表達(dá)消失，停藥后第14天，仍無(wú)nestin表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)；4．與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元在停藥后第14天，nestin的表達(dá)減弱，但仍存在。5．停藥后第14天，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組鼠耳蝸感覺(jué)上皮均見(jiàn)GFAP表達(dá)，兩組之間無(wú)差異，但在螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元均未見(jiàn)GFAP表達(dá)。 結(jié)論：1.Nestin在出生后大鼠耳蝸感覺(jué)上皮及螺旋神