順鉑對小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞形態(tài)及otoferlin蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、背景及研究目的:
　　順鉑是一種高效的化療藥,在臨床上被廣泛用于抗腫瘤治療,包括生殖細(xì)胞腫瘤、鼻咽癌、肺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌及睪丸癌等。然而,該藥也存在許多不良反應(yīng),如耳毒性、腎毒性、神經(jīng)毒性等。在使用順鉑化療的病人中,高達(dá)93％的患者可以出現(xiàn)感音神經(jīng)性聾,對于順鉑造成的耳毒性,目前尚無有效的治療方法。因此,對于順鉑造成的耳毒性機(jī)制研究十分重要。有研究發(fā)現(xiàn)順鉑進(jìn)入耳蝸后首先被毛細(xì)胞攝取,而支持細(xì)胞攝取順鉑的能力相對較弱,這就提示

2、毛細(xì)胞可能是聽功能損傷的主要靶細(xì)胞。
　　內(nèi)耳毛細(xì)胞是真正的感覺細(xì)胞,它將聲音信息傳遞到中樞神經(jīng)系統(tǒng)。內(nèi)毛細(xì)胞突觸是一種感覺信息損失最小的模擬系統(tǒng),具有亞毫秒級的精確度并且具有最高效率的囊泡釋放和回收的特點(diǎn)。內(nèi)毛細(xì)胞與傳入神經(jīng)末梢構(gòu)成特殊的帶狀突觸,otoferlin蛋白是內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸上的功能蛋白,可以與 synaptotagminI(突觸結(jié)合蛋白 I)、胞漿磷脂酶 A2、Ras相關(guān)的 GTP結(jié)合蛋白等結(jié)合,它在胞膜運(yùn)輸、信號

3、傳遞及遞質(zhì)釋放等方面起著重要作用。有研究表明在成熟小鼠耳蝸中該蛋白僅在內(nèi)毛細(xì)胞中高表達(dá),被認(rèn)為是Ca2+感受器,與內(nèi)毛細(xì)胞胞吐過程密切相關(guān),它的損傷可導(dǎo)致聽覺功能下降。
　　目前順鉑對聽功能損傷的具體機(jī)制尚不明確,主要存在兩種假說:一種假說認(rèn)為順鉑作為一種高反應(yīng)性分子,一旦進(jìn)入內(nèi)耳細(xì)胞就可以通過水合反應(yīng)轉(zhuǎn)化為更有活性的水分子形式結(jié)合許多生物大分子,如RNA、蛋白、膜磷脂、微絲及DNA等,進(jìn)而造成聽力的損傷。另一種假說認(rèn)為,順鉑進(jìn)入

4、耳蝸細(xì)胞后,可激發(fā)產(chǎn)生大量的自由基,這些自由基增多可引起毛細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高并導(dǎo)致毛細(xì)胞凋亡。以往的實(shí)驗(yàn)主要研究順鉑對外毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷,但是針對順鉑對內(nèi)毛細(xì)胞損傷的研究較少。本實(shí)驗(yàn)主要研究順鉑尤其是低劑量順鉑對聽功能的損傷,以及其損傷是否與內(nèi)毛細(xì)胞本身及其功能蛋白o(hù)toferlin有關(guān)。因此,本研究內(nèi)容是建立低劑量順鉑聽覺損傷模型,觀察內(nèi)毛細(xì)胞形態(tài)變化及otoferlin蛋白的表達(dá)情況,豐富順鉑造成聽功能損傷的機(jī)制,并為

5、臨床防護(hù)順鉑對聽功能的損傷提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。同時為后續(xù)進(jìn)一步研究otoferlin蛋白調(diào)節(jié)機(jī)制提供損傷模型。
　　方法:
　　1、將雄性C57小鼠(8周-12周齡)隨機(jī)分為7組,每組8只。分別為第一組:正常對照組,其余各組腹腔注射順鉑。第二組:順鉑的劑量為0.75mg/(kg×d),連續(xù)注射4d;第三組:注射劑量為1.5mg/(kg×d),連續(xù)注射4d;第四組:注射劑量為3.0mg/(kg×d),連續(xù)注射4d;第五組:注射劑

6、量為0.75mg/(kg×d),連續(xù)注射7d;第六組:注射劑量為1.5mg/(kg×d),連續(xù)注射7d;第七組:注射劑量為3.0mg/(kg×d),連續(xù)注射7d。
　　2、小鼠聽性腦干反應(yīng)(ABR)閾值測定:用藥結(jié)束后對各組小鼠聽閾進(jìn)行測定,使用SPSS18.0軟件,采用 t檢驗(yàn)和單因素方差分析所得聽閾值,P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　3、內(nèi)毛細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:利用5%AgNO3耳蝸基底膜染色,于光學(xué)顯微鏡下觀察內(nèi)毛細(xì)胞形

7、態(tài)變化,分別在不同劑量和不同時間點(diǎn)進(jìn)行對比;
　　4、采用免疫熒光法、RT-PCR測定基底膜內(nèi)毛細(xì)胞otoferlin蛋白的表達(dá),檢測順鉑對耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞otoferlin蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1、聽功能情況(ABR閾值):同一時間對比中,用藥4天的實(shí)驗(yàn)組與正常組比較,1.5mg/kg組和3.0mg/kg組存在明顯差異(P<0.05),且隨著劑量的增加,閾值增高越明顯;用藥7天的實(shí)驗(yàn)組與正常組相比聽力均明顯下

8、降(P<0.05),0.75mg/kg組和1.5mg/kg組平均值相同,3.0mg/kg組較前兩組閾值增高。同一劑量的情況下,0.75mg/kg×7d組比0.75mg/kg×4d組損傷更重(P<0.05),其余劑量造成的損傷在不同時間點(diǎn)無明顯差異。
　　2、內(nèi)毛細(xì)胞AgNO3染色:正常小鼠內(nèi)毛細(xì)胞呈圓形,大小均一,細(xì)胞間隙清楚,胞膜表面光滑,可觀察到呈“一”字型的纖毛;0.75mg/kg×4d組內(nèi)毛細(xì)胞呈橢圓形,大小無明顯改變,細(xì)

9、胞間隙清楚,胞膜表面光滑,未見纖毛結(jié)構(gòu);1.5mg/kg×4d組內(nèi)毛細(xì)胞呈橢圓形,大小無明顯改變,細(xì)胞間隙縮小,胞膜不光滑,未見纖毛結(jié)構(gòu);3.0mg/kg×4d組內(nèi)毛細(xì)胞呈橢圓形,體積明顯減小,細(xì)胞間隙縮小,細(xì)胞膜皺縮,未見纖毛結(jié)構(gòu);0.75mg/kg×7d組內(nèi)毛細(xì)胞呈橢圓形,體積稍有減小,細(xì)胞間隙縮小,胞膜皺縮,未見纖毛結(jié)構(gòu);1.5mg/kg×7d組內(nèi)毛細(xì)胞細(xì)胞呈橢圓形,體積縮小,細(xì)胞間隙不清,胞膜無法辨認(rèn),未見纖毛結(jié)構(gòu);3.0mg/

10、kg×7d組內(nèi)毛細(xì)胞細(xì)胞呈圓形,體積明顯縮小,細(xì)胞間隙明顯增寬,胞膜無法辨認(rèn)。
　　3、otoferlin蛋白免疫熒光染色:正常小鼠內(nèi)毛細(xì)胞otoferlin綠色熒光表達(dá)均一完整,。隨著用藥劑量和時間的增加,otoferlin蛋白發(fā)生相應(yīng)的改變,但 DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核仍存在,即內(nèi)毛細(xì)胞未缺失。其中第7組(3.0mg/kg×7d)較正常組蛋白熒光灰度值明顯降低,即表達(dá)量明顯降低,其余各組無明顯區(qū)別,第3組(1.5mg/kg×4d)

11、灰度值和第6組(1.5mg/kg×7d)較其他用藥組明顯升高。
　　4、otoferlin RT-PCR:0.75mg/kg與3.0mg/kg實(shí)驗(yàn)組相比,RNA表達(dá)量均下降;而1.5mg/kg實(shí)驗(yàn)組無明顯下降,余各實(shí)驗(yàn)組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　1、成功建立了穩(wěn)定的低劑量順鉑損傷聽功能小鼠模型,發(fā)現(xiàn)順鉑損傷聽功能與時間和劑量相關(guān),隨著用藥時間和劑量的增加,小鼠的聽力損傷逐漸加重;但0.75mg/(kg×d)×

12、7d組和1.5mg/(kg×d)×7d組ABR閾值改變相同,考慮在一定損傷條件下可能會激發(fā)小鼠耳蝸?zhàn)晕冶Ｗo(hù)功能;
　　2、順鉑可以造成內(nèi)毛細(xì)胞形態(tài)上不同程度的損傷;
　　3、免疫熒光圖片發(fā)現(xiàn),順鉑可以造成otoferlin蛋白表達(dá)改變。隨劑量和時間不同, otoferlin蛋白表達(dá)亦不同,蛋白表達(dá)的變化與內(nèi)毛細(xì)胞形態(tài)改變并非同步關(guān)系。
　　4、綜上所述,順鉑造成的聽功能損傷與內(nèi)毛細(xì)胞有關(guān),其損傷程度和劑量、時間呈相關(guān)性

13、,即損傷越重內(nèi)毛細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變越明顯;順鉑造成的聽功能損傷可能與內(nèi)毛細(xì)胞突觸蛋白o(hù)toferlin有關(guān),但其損傷程度和劑量、時間不成正比性,并且和內(nèi)毛細(xì)胞形態(tài)學(xué)非同步性損傷。考慮其原因可能是由于內(nèi)毛細(xì)胞中儲存的mRNA在順鉑的刺激下,增加了蛋白質(zhì)的合成,減緩聽功能的損傷。3.0mg/kg組的聽功能損傷加重且PCR結(jié)果表達(dá)下降,考慮為該劑量對內(nèi)毛細(xì)胞造成的損傷超過小鼠自我保護(hù)能力,順鉑可能從DNA、RNA、蛋白水平結(jié)合otoferlin,