siRNA沉默TGF-β1基因表達(dá)對肺癌順鉑耐藥細(xì)胞的影響.pdf

1、目的:國內(nèi)外研究及本課題前期實驗均證實腫瘤耐藥性的產(chǎn)生與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)之間具有相關(guān)性。本實驗以EMT主要調(diào)控因子——轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)為切入點(diǎn)，探討TGF-β1小干擾RNA(Small interfering RNA， siRNA)對A549順鉑耐藥細(xì)胞(A549/DDP)耐藥性的影響，進(jìn)一步了解肺癌細(xì)胞順鉑耐藥性的發(fā)生機(jī)制，并從EMT的角

2、度尋找耐藥性腫瘤治療的新思路。
　　方法:設(shè)計TGF-β1 siRNA基因片段，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞，采用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)觀察轉(zhuǎn)染前后A549/DDP細(xì)胞EMT表型標(biāo)記物E-cadherin、vimentin以及耐藥蛋白ERCC1mRNA及蛋白表達(dá)情況，CCK-8法檢測各組細(xì)胞再次添加順鉑后增殖活性變化及化療藥物的敏感性變化。
　　結(jié)果:
　　1.與A549細(xì)胞相比，A549/DDP細(xì)胞呈長梭形

3、、排列呈旋渦狀或放射狀，類似纖維細(xì)胞;免疫細(xì)胞化學(xué)顯示細(xì)胞的上皮標(biāo)志物E—cadherin表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物vimentin表達(dá)上調(diào)，這些都與EMT發(fā)生時的典型特征相符合。
　　2.TGF-β1 siRNA轉(zhuǎn)染后，RT-PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)均觀察到A549/DDP細(xì)胞E-cadherin表達(dá)增強(qiáng)，vimentin表達(dá)下調(diào)，并且耐藥因子ERCC1 mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)。
　　3.CCK-8法檢測各組細(xì)胞耐藥指數(shù)及再次添加順

4、鉑后的生長活性變化，結(jié)果顯示A549/DDP細(xì)胞耐藥指數(shù)2.77，而A549/A549/DDP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞耐藥指數(shù)1.28，兩組具有顯著差異性(P=0.000);且A549/DDP轉(zhuǎn)染組與A549/DDP細(xì)胞相比，在添加順鉑24h、48h及72h后抑制率均明顯升高(P=0.000)，而轉(zhuǎn)染陰性對照組未見明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.A549/DDP細(xì)胞在獲得耐藥性的同時呈現(xiàn)EMT，TGF-β1 siRNA轉(zhuǎn)染