siRNA干擾survivin基因聯(lián)合順鉑對SGC7901細胞生長影響的實驗研究.pdf

1、存活素(survivin)是由耶魯大學(xué)的Altieri等在1997年發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs),具有強大的抗凋亡功能,屬于凋亡抑制因子家族成員之一。人類的survivin蛋白是一類胞質(zhì)蛋白,在大多數(shù)正常組織測不到其表達;而絕大多數(shù)癌組織存在survivin蛋白表達。順鉑(cisplatin,DDP)由于其抗腫瘤作用明顯、價格低廉,并且可應(yīng)用于多種腫瘤的化療,是目前臨

2、床上最常用的化療藥物之一。近年來對腫瘤化療藥物的研究表明,某些腫瘤細胞在長期應(yīng)用順鉑后出現(xiàn)藥物療效下降,同時可檢測到survivin的高表達。本實驗通過將人工合成的survivin siRNA經(jīng)lip包裹后轉(zhuǎn)染SGC7901細胞,探討siRNA聯(lián)合順鉑能否增強對SGC7901的抑制作用及誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的能力,從而為臨床胃癌的化療開辟一條新路徑。
　　 目的:研究梯度濃度順鉑在不同時間下作用于SGC7901細胞,對其增殖抑制作用

3、的影響;觀察survivin siRNA轉(zhuǎn)染SGC7901細胞后survivin表達的改變;檢測細胞轉(zhuǎn)染survivin siRNA聯(lián)合順鉑對該細胞抑制作用和早期凋亡率的變化。
　　 方法:細胞培養(yǎng):SGC7901細胞常規(guī)培養(yǎng)于含有10％胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中,置于37℃、.5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中。通過lip包裹人工合成的survivin siRNA轉(zhuǎn)染S

4、GC7901細胞,熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及轉(zhuǎn)染情況;MTT法檢測各組腫瘤細胞的增殖抑制率(IR);免疫細胞化學(xué)染色(SP法)、免疫細胞熒光染色和Western blot分別檢測survivin蛋白的表達情況;Hoechst33258染色觀察細胞凋亡的形態(tài)及流式細胞儀(FCM)檢測細胞早期凋亡率。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT檢測結(jié)果:①順鉑對細胞的增殖抑制影響:與同時間點的control組相比,梯度順鉑組細胞增殖抑制

5、率明顯增高(P＜0.05);1.0mg/L順鉑作用細胞24h、48h及72h的增殖抑制率分別為(22.54±2.13)％、(37.44±4.56)％和(40.58±4.76)％,隨著作用時間的延長,其增殖抑制率并沒有明顯上升,72h的增殖抑制率與48h的相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。②轉(zhuǎn)染survivin siRNA對細胞也有一定的增殖抑制作用,其作用強于lip組(9.19±1.48)％和siRNA組(5.00±1.55)％(

6、P＜0.05)。③轉(zhuǎn)染survivin siRNA聯(lián)合1.0mg/L順鉑組作用細胞后72h,其增殖抑制率(63.93±4.22)％明顯高于單用順鉑組(42.97±2.73)％和轉(zhuǎn)染組(19.16±1.65)％,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.免疫細胞熒光染色結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染survivin siRNA后,細胞中survivin蛋白表達明顯少于control組、lip組和siRNA組。
　　 3.survivi

7、n蛋白表達的變化情況:①免疫細胞化學(xué)染色:與相同時間點control組相比,轉(zhuǎn)染siRNA組和轉(zhuǎn)染survivin siRNA聯(lián)合順鉑組細胞中survivin蛋白的表達明顯降低(P＜0.05),而順鉑組survivin蛋白的表達升高(P＜0.05);順鉑組作用細胞后72h,細胞中survivin蛋白表達明顯高于作用細胞后48h(P＜0.05)。②Westernblot檢測結(jié)果顯示:順鉑組作用細胞后,細胞中survivin表達量明顯高于c

8、ontrol組,而順鉑作用細胞后72h,細胞中survivin蛋白的含量高于作用細胞48h。差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.各組細胞經(jīng)處理后72h凋亡檢測結(jié)果:①Hoechst33258熒光染色法結(jié)果顯示:順鉑和轉(zhuǎn)染siRNA作用細胞后72h都能誘導(dǎo)細胞的凋亡,鏡下可見細胞核染色增強,核質(zhì)濃縮、核碎裂,呈凋亡改變。②FCM檢測結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染組和順鉑組作用細胞后72h細胞早期凋亡率分別為(11.90±1.16)％和

9、(19.85±1.43)％,均低于聯(lián)合作用組(33.92±2.01)％,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)?？梢娂毎D(zhuǎn)染survivinsiRNA后,能夠明顯增強順鉑誘導(dǎo)SGC7901細胞凋亡的能力。
　　 結(jié)論:
　　 1.順鉑和轉(zhuǎn)染survivin siRNA都能夠抑制SGC7901細胞的增殖。
　　 2.轉(zhuǎn)染survivin siRNA聯(lián)合順鉑能夠增強對SGC7901細胞的增殖抑制作用。
　　 3.轉(zhuǎn)