RASSF1A基因抑制胃癌細(xì)胞SGC7901生長(zhǎng)及其機(jī)制研究.pdf

1、前言:胃癌是一種常見(jiàn)的上皮源性惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅人民的身體健康,目前仍然是我國(guó)死亡率最高的惡性腫瘤之一。胃癌的發(fā)生發(fā)展是與遺傳因素、環(huán)境因素等多因素多步驟相關(guān)的過(guò)程,在這個(gè)過(guò)程中可能涉及到多個(gè)癌基因的激活與抑癌基因的失活,但其分子發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。分子遺傳學(xué)研究表明,多數(shù)實(shí)體腫瘤存在3號(hào)染色體短臂等位基因缺失,提示3p區(qū)域可能隱含腫瘤抑制基因。3p缺失在胃癌中也是常見(jiàn)事件之一。RASSF1A基因位于3p21.3,是最近確定的一種候選

2、抑癌基因,它在多人類惡性腫瘤中存在缺失;敲除RASSF1A基因可導(dǎo)致動(dòng)物模型中胃腸道腫瘤、肺癌、乳腺癌和淋巴瘤的發(fā)生。因此RASSF1A是人類腫瘤發(fā)生中非常重要的候選抑癌基因。但目前對(duì)于RASSF1A是否抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及其機(jī)制國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　目的:探討RASSF1A基因?qū)ξ赴┘?xì)胞SGC7901生長(zhǎng)的影響及其可能的作用機(jī)制。
　　方法:將RASSF1A基因轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株SGC7901,WesternBlotting

3、和RT-PCR篩選RASSF1A高表達(dá)克隆。MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期和凋亡率的變化,平板克隆形成試驗(yàn)分析細(xì)胞的增殖能力,裸鼠成瘤試驗(yàn)分析其致瘤性,觀察RASSF1A基因?qū)ξ赴┘?xì)胞株SGC7901生長(zhǎng)的影響。應(yīng)用EMSA觀察RASSF1A對(duì)SGC7901細(xì)胞NF-κB、AP-1 DNA結(jié)合活性的影響,Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)觀察RASSF1A對(duì)SGC7901細(xì)胞c-Fos、c-Jun和P65表達(dá)的

4、影響。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),比較空白質(zhì)粒和陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的蛋白表達(dá)譜,并應(yīng)用RT-PCR驗(yàn)證獲得的差異蛋白質(zhì)點(diǎn),系統(tǒng)探討RASSF1A基因抑制胃癌細(xì)胞SGC7901生長(zhǎng)的作用機(jī)制。
　　結(jié)果:經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和篩選,建立了高表達(dá)RASSF1A基因的SGC7901細(xì)胞系。MTT結(jié)果顯示:與未轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較,陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯減慢,48 h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為28.13％。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:與未轉(zhuǎn)染組和

5、空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比,陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SGC7901細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加,而S期比例減少,細(xì)胞凋亡率有所增加。平板克隆形成試驗(yàn)結(jié)果顯示:未轉(zhuǎn)染組、空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SGC7901細(xì)胞的克隆形成率分別為38.6±1.5%,39.7±2.1%和7.3±0.6%,陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組克隆形成率明顯減少。裸鼠成瘤試驗(yàn)結(jié)果顯示:未轉(zhuǎn)染組、空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SGC7901細(xì)胞成瘤潛伏期均為7天,瘤體重量分別為(1.4±0.

6、26)g、(1.5±0.32)g和(0.6±0.1)g,陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組裸鼠成瘤抑制率為57.1%。在細(xì)胞未作處理時(shí),與未轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較,陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞NF-κB DNA結(jié)合活性明顯降低。長(zhǎng)春新堿作用12h和24h后,三組細(xì)胞NF-κB DNA結(jié)合活性下降;但與未轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較,陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SGC7901細(xì)胞NF-κB DNA結(jié)合活性下降更明顯。在阿糖胞苷作用12h后,SGC7901細(xì)胞NF-κBDNA結(jié)合活

7、性上升;但陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SGC7901細(xì)胞NF-κB DNA結(jié)合活性較未轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)明顯下降。Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:與未轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較,陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SGC7901細(xì)胞全細(xì)胞中p65表達(dá)明顯降低,細(xì)胞核中p65表達(dá)也降低。與未轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較,陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SGC7901細(xì)胞AP-1 DNA結(jié)合活性明顯降低。Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:與未轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒

8、轉(zhuǎn)染組比較,陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SGC7901細(xì)胞c-Fos表達(dá)明顯降低,但c-Jun表達(dá)未見(jiàn)明顯變化。蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示:通過(guò)雙向凝膠電泳分別分離RASSF1A轉(zhuǎn)染細(xì)胞和pcDNA3.0空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總蛋白質(zhì),測(cè)得兩組細(xì)胞的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)分別為869±23和792±53個(gè);位置重復(fù)性分析表明陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SGC7901細(xì)胞在等電聚焦(IEF)方向上的平均偏差為0.856±0.113 mm,在垂直板SDS-PAGE電泳方向上的平均位置偏差為

9、1.021±0.129mm;空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞在IEF方向上的平均偏差為0.847±0.125 mm,在垂直板SDS-PAGE電泳方向上的平均位置偏差為1.105±0.127 mm。以上結(jié)果表明我們成功地建立了分辨率較高、重復(fù)性較好的陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的二維凝膠電泳圖譜。將陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞2D凝膠圖譜上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行匹配分析,平均匹配點(diǎn)數(shù)為695±18個(gè),獲得差異點(diǎn)35個(gè)。隨機(jī)選取12個(gè)

10、蛋白質(zhì)差異點(diǎn),凝膠內(nèi)原位酶解后,將經(jīng)MALDI-TOF質(zhì)譜分析獲得的肽質(zhì)量指紋圖(PMF)搜索MS數(shù)據(jù)庫(kù),成功鑒定8個(gè)蛋白質(zhì),包括Galectin-1、TRP-14、ACBP、PSMB5、PSMB4、TIM、Vimentin、CD79。進(jìn)一步應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)了Galectin-1、TRP-14、ACBP在SGC7901細(xì)胞中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Galectin-1、TRP-14、ACBP表達(dá)高于對(duì)照組,表明RASSF1A能上調(diào)Ga

11、lectin-1、TRP-14、ACBP的表達(dá)。
　　結(jié)論:1、RASSF1A過(guò)表達(dá)能抑制胃癌細(xì)胞SGC7901的生長(zhǎng)。RASSF1A可能是胃癌抑制基因;2、抑制胃癌細(xì)胞SGC7901 NF-κB、AP-1活性可能是RASSF1A抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制之一;3、我們通過(guò)建立分辨率較高、重復(fù)性較好的空白質(zhì)粒和陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞的二維凝膠電泳圖譜,首次發(fā)現(xiàn)RASSF1A過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)了胃癌細(xì)胞SGC7901的Galectin-