shRNA特異性抑制胃癌SGC7901細(xì)胞NRAGE基因的表達(dá).pdf

1、RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是將雙鏈RNA(doublestrandRNA，dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)引起同源mRNA降解的一種細(xì)胞反應(yīng)過程。dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后被特異性dsRNA核酸酶(Dicer)切割成多個(gè)2卜23nt的短干擾RNA(shortinterferingRNA，siRNA)，siRNA與一些核酸酶結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA—inducedsilencingcomplex，RISC)，由R

2、ISC介導(dǎo)同源mRNA的降解，屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post—transcriptionalgenesilencing，PTGS)。短發(fā)夾狀RNA(shorthairpinRNA，shRNA)由短的正義鏈、反義鏈(19—2Int)和連接它們的數(shù)個(gè)堿基組成，正義鏈、反義鏈呈反向重復(fù)序列，因其形似發(fā)夾而得名。1998年被發(fā)現(xiàn)以來，作為有力工具，RNAi技術(shù)已廣泛被用于白血病、病毒性肝炎、大腸癌、食管癌、肝癌、卵巢癌等多種人類腫瘤的研究，但應(yīng)用

3、其研究胃癌近年才見報(bào)道。 NRAGE基因是1999年發(fā)現(xiàn)的黑色素瘤抗原編碼基因(MAGE)中的MAGE-D亞族中的新成員，又名MAGE—Dl和Dlxin-1。不同于MAGE家族多在腫瘤和胚胎組織中表達(dá)，NRAGE基因在胚胎組織、腫瘤組織中以及正常組織中都有表達(dá)。在神經(jīng)組織、胚胎組織中NRAGE蛋白與P75~R神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白受體相互作用，通過JNK依賴的線粒體途徑誘導(dǎo)caspase激活和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，是一個(gè)凋亡誘導(dǎo)子。此外，NRAG

4、E作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控子與dlx向sx轉(zhuǎn)錄因子家族相互作用，參與細(xì)胞周期的調(diào)控。近來，國(guó)內(nèi)有報(bào)道NRAGE基因還參與胰腺癌PANC．1細(xì)胞間的黏附作用。今天，NRAGE基因越來越多的作用和功能被發(fā)現(xiàn)，但是應(yīng)用RNAi方法研究NRAGE基因在胃癌中的表達(dá)較少見報(bào)道。 本研究應(yīng)用RNAi技術(shù)干預(yù)胃癌SGC7901細(xì)胞NRAGE基因的表達(dá)，通過盯一PCR檢測(cè)抑制后NRAGE基因表達(dá)情況，用FCM、MTT等方法從反效應(yīng)揭示NRAGE基因的功能，

5、研究NRAGE基因在胃癌SGC7901細(xì)胞中發(fā)生發(fā)展中的作用，為今后進(jìn)一步揭示NRAGE基因功能和作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料與方法 1．細(xì)胞培養(yǎng) SGC7901用RPMll640培養(yǎng)基，置于37*(2，5％C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，該培基含10％胎牛血清，lOOu/m1青霉素，100μg／m1鏈霉素。轉(zhuǎn)染前改用雙無培養(yǎng)基RPMll640。 2．對(duì)照組質(zhì)粒的制備及pSUPER-EGFP—NRG的鑒定 用

6、EcoRI和HindlII~酶切已構(gòu)建好的pSUPER-EGFP—NRG載體，1％的瓊脂糖凝膠電泳回收質(zhì)粒片段，用Klenow大片段和T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)菌TGl中，鋪板后Kana抗性篩選。陽(yáng)性克隆用化HpaI單酶切，1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將連接好的質(zhì)粒命名為pSUPER-EGFP。同時(shí)將質(zhì)粒pSUPER—EGFP—NRG測(cè)序。 3．優(yōu)化質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染后的G418濃度 把SGC7901轉(zhuǎn)入6孔板中，細(xì)胞

7、數(shù)為1×lOs個(gè)。按200ug／ml、400ug／m1、600ug／m1、800ug／m1、1000μg／m1的G418濃度梯度加入G418，以3—5d后對(duì)照組細(xì)胞全部死亡的G418濃度為標(biāo)準(zhǔn)濃度。設(shè)立對(duì)照組。 4．質(zhì)粒的純化與轉(zhuǎn)染 用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒抽提pSUPER-EGFP-NRG與pSUPER—EGFP，把SGC7901細(xì)胞隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、空白對(duì)照組，用Lifectaminem2000轉(zhuǎn)染試劑將p

8、SUPER-EGFP-NRG轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞、將pSUPER-EGFP轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)對(duì)照組細(xì)胞、空白對(duì)照組細(xì)胞中僅轉(zhuǎn)入脂質(zhì)體Lifectanine~2000，24h后換完全培養(yǎng)基RPMll640。 5．篩選與擴(kuò)增 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在37~C、5％C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72h后，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板后，按1：5的密度比例傳代至新的6孔培養(yǎng)板，并設(shè)立對(duì)照組。次日，更換為含況，4d后，待對(duì)照組細(xì)胞全部死亡后，更換為完全培養(yǎng)基RPMll640

9、。待陽(yáng)性細(xì)胞克隆形成后，用200μl的Tip挑入24孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板后，移入培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。 6．轉(zhuǎn)染后檢測(cè)：RT—PCR、流式細(xì)胞術(shù)、btTT比色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NRAGE的表達(dá)和癌細(xì)胞生長(zhǎng)情況。 7．統(tǒng)計(jì)方法：應(yīng)用SPSS11．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件和方差分析來分析比較各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。P

10、與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、空白對(duì)照組處于Gl期的細(xì)胞相比有顯著差異，(F=69．35，P<0．05)；實(shí)驗(yàn)組處于S期的細(xì)胞明顯多于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與空白對(duì)照組細(xì)胞，且與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F：64．34，P<0．05)；實(shí)驗(yàn)組處于G2期的細(xì)胞明顯少于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與空白對(duì)照組細(xì)胞，且與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、空白對(duì)照組相比有顯著差異(F=8．99，P<0．05)，(2)調(diào)亡檢測(cè)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞未測(cè)到調(diào)亡指數(shù)，而實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、空白對(duì)照組調(diào)亡指數(shù)分別為6．

11、93±0．¨55和7．87±0．0578。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞調(diào)亡現(xiàn)象不明顯。 2．半定量RT一PCR檢測(cè)結(jié)果 pSUPER—EGFP—NRG／SGC7901和pSUPER-EGFP／SGC7901和SGC7901中的NRAGE及B—action基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為567nt和315nt，與理論上的NRAGE及B—action產(chǎn)物長(zhǎng)度相符。條帶的灰度值(NRAGE／B—action)均值分別為0、0．1503±0．0049

12、5、O．1575±0．01072。實(shí)驗(yàn)組比值較對(duì)照組有顯著差別(P<0．05)。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組較空白對(duì)照組無顯著差別(p>O．05)。說明NRAGE基因在胃癌組織中表達(dá)量較低且實(shí)驗(yàn)組中的NRAGE基因幾乎全部被抑制。 3．MTT檢測(cè)結(jié)果 24hpSUPER-EGFP—NRG／SGC7901和pSUPER—EGFP／SGC7901細(xì)胞存活率分別為1．085±0．179；1．051±0．294。48h細(xì)胞存活率分別為1．350±

13、0．357：1．037±0．291。96h細(xì)胞存活率分別為1．736±0．134；1．038±0．267。兩實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后每天所測(cè)存活率均顯著高于對(duì)照組(P