sirna特異性抑制h.pyloriflaa、caga基因表達(dá)

1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文siRNA特異性抑制H.pylori flaA、cagA基因表達(dá)姓名：嚴(yán)燕國(guó)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：詹文華20060401◇中山大學(xué)博士論文 s i R N A 特異性抑制H ．p y l o r if l a A 、c a g A 基因表達(dá)鞭毛蛋白，決定著H p 鞭毛的功能。c a g A 基因是H p 的重要毒力基因，以它作為H p的毒力標(biāo)志，可將H p 分炭J c a g A + 菌株和c a

2、g A ’菌株兩大類，研究顯示c a g A + 菌株感染者胃粘膜炎癥、損傷程度較c a g A ‘菌株重，提示c a g A 基因可能與H p 感染相關(guān)炎癥發(fā)生有關(guān)，具體機(jī)制尚不明確；c a g A + 菌株感染者胃癌發(fā)生的危險(xiǎn)較c a g A ‘菌株高數(shù)倍，表明c a g A 基因與H p 感染相關(guān)胃癌關(guān)系密切，因此深入地了解c a g A 的功能具有十分重要的意義。由于H p 是革蘭氏陰性桿菌，生長(zhǎng)較緩慢，對(duì)外界環(huán)境敏感，培養(yǎng)易遭

3、污染，不易人工轉(zhuǎn)化，國(guó)內(nèi)外有關(guān)其轉(zhuǎn)化的方法及報(bào)道不多，電轉(zhuǎn)化的報(bào)道更少，本實(shí)驗(yàn)擬以I 塒A i 為工具研究H p 基因并試圖干擾其基因表達(dá)，因而對(duì)其轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化是十分必要的?！緦?shí)驗(yàn)分為以下三部分：第一部分s i R N A 抑制l i p f l a A 基因表達(dá)目的優(yōu)化H p 的電轉(zhuǎn)化條件；利用s i R N A 特異性抑制f l a A 基因表達(dá)。方法設(shè)計(jì)熒光標(biāo)記的非特異性s i R N A ，組合不同的電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖時(shí)間、細(xì)

4、菌濃度與s i R N A 濃度；找到電轉(zhuǎn)化H p 的最佳條件，觀察轉(zhuǎn)化效率和H p 存活率；然后設(shè)計(jì)針對(duì)基因序列已明確的f l a A 基因( N O ．A Y 3 1 9 2 9 8 ) 的特異性s i R N A 分子S I - S 5 及非特異性s i R N A 分子一S 6 ，在最佳電轉(zhuǎn)化條件下將s i R N A 轉(zhuǎn)化H p ，R T - P C R 方法檢測(cè)f l a A m R N A 的抑制率。實(shí)驗(yàn)分組：f l a

5、A —S l ，f l a A —S 2 ，f l a A —S 3 ，f l a A —S 4 ，f l a A —S 5 ，對(duì)照組：f l a A ．S 6 。結(jié)果電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖時(shí)間是影響轉(zhuǎn)化效率的兩個(gè)關(guān)鍵因素，最佳轉(zhuǎn)化條件為2 5 k V ／c m 電場(chǎng)強(qiáng)度下脈沖6 m s ，當(dāng)細(xì)菌濃度為1 0 8 C F U ／m l ，s i R N A 為1 0 0 9 9 ／m l 時(shí)電轉(zhuǎn)化率最高達(dá)9 5 ％，高于其它組( PO ．0 5

6、 ) 。f l a A —s 2 、f l a A —s 3組在轉(zhuǎn)化后f l a Am R N A 抑制率隨s i R N A 濃度增大而增加，在1 0 0 9 9 ／m 1 分別為7 2 ．1 ％和5 3 ．8 ％高于1 0 9 9 ／m l 、1 ．0 9 9 ／m l 組( P < 0 ．0 5 ) 。結(jié)論適當(dāng)?shù)膱?chǎng)強(qiáng)和脈沖時(shí)間的組合可使轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值。特異性s i R N A 可以抑制H p f l a A 表達(dá)。第二部分