ICP27特異性siRNA抑制HSV-1病毒復制的實驗研究.pdf

1、單純皰疹病毒性腦炎(Herpes simplex virus encephalitis,HSE)是散發(fā)性病毒性腦炎中最常見的類型,其病情嚴重、發(fā)展迅速、病死率高?，F(xiàn)有的抗HSV-1藥物不能完全抑制和清除潛伏的病毒,且耐藥性強。95％的成人HSE由單純皰疹病毒1型(Herpes simplex virus type1,HSV-1)引起,HSV-1是雙鏈的包膜DNA病毒,按照基因表達的時序性,基因組可分為立即早期基因(immediate-e

2、arly,IE)、早期基因(early,E)和晚期基因(late,L)。ICP27(infected cellprotein,感染細胞蛋白)為63 KDa的感染細胞蛋白,是HSV-1病毒復制必需的關(guān)鍵激活子,在HSV-1生命周期的IE期產(chǎn)生。ICP27抑制宿主細胞mRNA剪接,補充病毒復制位點的RNAⅡ聚合酶,促進病毒轉(zhuǎn)錄體核輸出；抑制IE、E基因,活化L基因,促使E基因想L基因表達,刺激病毒轉(zhuǎn)錄翻譯；同時與抑制Ⅰ型干擾素信號和HSV-

3、1病毒體的合成相關(guān)。
　　 RNA干擾是近年來發(fā)展起來的轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程,其作為一種新型基因阻斷技術(shù)與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)以及反義技術(shù)相比,具有特異性強、效能高、作用迅速、毒性低、操作簡便等優(yōu)點,已被廣泛應用于感染性病毒的基因治療研究,并取得了令人鼓舞的效果。
　　 本實驗通過建立穩(wěn)定表達ICP27序列特異性siRNA的重組Vero-siRNA細胞系,初步分析抑制ICP27對HSV-1在Vero細胞中復制能力的影響,探索

4、ICP27缺失是否具有阻斷HSV-1復制的可能,從而為確定ICP27基因作為HSV-1的抗病毒藥物靶點奠定實驗基礎。
　　 目的:
　　 1建立穩(wěn)定表達ICP27序列特異性siRNA的重組Vero-siRNA細胞系。
　　 2初步分析ICP27序列特異性siRNA對HSV-1體外復制的抑制作用。
　　 方法：
　　 1以HSV-1 ICP27基因為靶點,設計3對特異性siRNA,退火連接到慢病毒質(zhì)

5、粒pLKO.1-puro,構(gòu)建重組pLKO.1-puro-siRNA慢病毒表達載體,利用MluⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定。
　　 2利用脂質(zhì)體2000將pLKO.1-puro-siRNA、△8.2、VSV-G三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞得到重組慢病毒。
　　 3重組慢病毒感染Vero細胞,經(jīng)Puromycin加壓篩選,有限稀釋后挑取單個細胞克隆擴大培養(yǎng),即得到重組Vero-siRNA細胞系。
　　 4野生型HSV-1病

6、毒感染重組細胞,利用Realtime PCR和Western blot分別檢測各組細胞內(nèi)ICP27 mRNA和蛋白表達情況。
　　 5用MOI=0.1的野生型HSV-1病毒感染各組細胞,24 h后觀察各組細胞病變效應情況,并收集細胞和上清,利用TCID法測定各組病毒滴度。
　　 6采用單因素方差分析(One-way analysis of variance,ANOVA),以α=0.05為檢驗水準對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

7、r>　　 結(jié)果：
　　 1 SiRNA退火連接到慢病毒質(zhì)粒pLKO.1-puro,篩選陽性菌落,經(jīng)酶切鑒定及測序顯示pLKO.1-puro-siRNA構(gòu)建成功。
　　 2嘌呤霉素加壓篩選和有限稀釋后成功篩選出ICP27序列特異性siRNA表達陽性的細胞克隆。
　　 3感染HSV-1后,Realtime PCR結(jié)果顯示重組Vero-siRNA組細胞內(nèi)ICP27mRNA表達的抑制效率均達85％以上(P<0.001)

8、,Western blot證實ICP27蛋白表達也較對照組明顯減弱。重組Vero-siRNA細胞系建立成功。
　　 4接種HSV-1后,實驗組細胞中細胞病變效應較空白對照組和陰性對照組少40％以上；TCID50結(jié)果顯示,Veto-siRNA組的病毒滴度比對照組降低約1～2 log10(P<0.001),ICP27序列特異性siRNA對HSV-1病毒復制的抑制率均到達80％以上,其中siRNA2抑制效率最高,約為97％。