UL54特異性siRNA對單純皰疹病毒Ⅱ型復(fù)制影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、研究背景: 生殖器皰疹(Genital Herpes，GH)是由單純皰疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)感染生殖器和肛門部位皮膚、粘膜而引起的一種慢性、易復(fù)發(fā)、難治愈的性傳播疾病。對于這種在人群廣泛流行、有潛在嚴(yán)重危害的病毒感染，目前卻沒有特效藥物治療。生殖器皰疹的病原體90％為HSV—2，10％為HSV-1。HSV基因組為一線性雙鏈DNA分子，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的形成可有時(shí)序上的先后，美國學(xué)者Roizman根

2、據(jù)基因表達(dá)時(shí)序的不同，將HSV的基因分為立即早期、早期、晚期基因，分別稱為α、β、γ基因，分別編碼立即早期蛋白、早期蛋白及晚期蛋白。立即早期基因的轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)在病毒DNA復(fù)制之前，調(diào)節(jié)著β、γ基因的表達(dá)。迄今為止，人們已知的HSV編碼的立即早期蛋白有五個(gè)，它們被稱為感染細(xì)胞多肽分子(infected cell polypeptides，ICPS)。包括ICPO，ICP4，ICP22，ICP27和ICP47。從位置上看，α27基因又稱為UL5

3、4，它編碼的ICP27具有復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用，是唯一能在皰疹病毒的每個(gè)亞科找到其同源蛋白的α蛋白。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)是近年來一種發(fā)展快并有應(yīng)用前景的基因控制技術(shù)。雙鏈RNA能夠被一種稱為Dicer的RNA酶加工成小分子干擾RNA(small interference RNA，siRNA)，隨后這些小干擾RNA與蛋白因子形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA—induced silencing

4、 complex，RISC)，該復(fù)合物可以識(shí)別并降解與siRNA具有同源序列的mRNA。RNAi作用具有高度的序列特異性，這種特異性抑制基因表達(dá)并使表現(xiàn)型喪失的方法類似于基因敲除的效果，故RNAi已成為研究基因功能的重要工具。自從2002年第一次報(bào)道RNAi在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能抑制病毒復(fù)制以來，RNAi已經(jīng)廣泛用于各種抗病毒研究，并取得大量令人振奮的結(jié)論。在國際上，針對HSV的RNA干擾治療研究起步相對較晚。到目前為止，可查閱的國內(nèi)外使用

5、RNAi技術(shù)治療HSV—2感染文獻(xiàn)不超過10篇，且絕大部分來自歐美國家。2006年，Palliser等發(fā)現(xiàn)，小鼠陰道宮頸粘膜上皮能攝取脂質(zhì)體包裹的siRNA，被攝取的siRNA在局部能產(chǎn)生效果。體外實(shí)驗(yàn)中，針對某些靶基因篩選出有效抑制HSV—2的siRNA；轉(zhuǎn)到體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，在陰道粘膜使用含siRNA的制劑，保護(hù)了受致死劑量HSV—2攻擊的小鼠。這些結(jié)果顯示了使用RNA干擾技術(shù)治療HSV感染的可能性、有效性以及矚目的前景。 HSV

6、—2病毒感染的周期以及其中有關(guān)的重要基因的表達(dá)特性是學(xué)者們選擇siRNA抗病毒靶點(diǎn)的重要依據(jù)。最近研究發(fā)現(xiàn)ICP27為病毒復(fù)制所必需，一旦發(fā)生突變則可能影響晚期基因的表達(dá)和DNA的合成。HSV—2具有相對獨(dú)立的自身復(fù)制酶系統(tǒng)，包括UL30、UL29、UL9、UL42編碼的復(fù)制相關(guān)酶，這些酶直接參與病毒DNA的復(fù)制，而ICP27的缺失可導(dǎo)致這些復(fù)制相關(guān)酶合成減少，影響病毒的復(fù)制；另一方面，在病毒與宿主細(xì)胞相互作用的過程中，ICP27通過抑

7、制宿主細(xì)胞原始RNA的剪接和加尾等成熟過程，與UL41基因編碼的病毒宿主關(guān)閉蛋白(Virion host shutoff protein，VHS蛋白)共同調(diào)節(jié)宿主mRNA的代謝過程，抑制宿主細(xì)胞蛋白的合成。可見，ICP27對于HSV—2來說是個(gè)關(guān)鍵的上游蛋白，且對宿主細(xì)胞代謝有重要影響，如能夠特異性地干擾ICP27的表達(dá)過程，則可能起到抗病毒和保護(hù)宿主細(xì)胞的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)利用RNA干擾技術(shù)，研究特異性siRNA對HSV—2復(fù)制的影響

8、，評價(jià)UL54基因在病毒復(fù)制中的作用，為確立其作為抗HSV—2的藥物靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)，為抗病毒治療提供新方法新思路。 二、研究目的: (1)根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，篩選UL54基因可能的靶位，合成實(shí)驗(yàn)組siRNA。 (2)探討在RNAi技術(shù)條件下，干擾ICP27合成對HSV—2復(fù)制的影響及對宿主細(xì)胞的保護(hù)作用，為有效抗病毒治療提供依據(jù)。 (3)篩選有效和特異性抑制UL54表達(dá)的siRNA分子。 (4)

9、評價(jià)UL54基因在HSV—2復(fù)制中的作用，為確立UL54基因作為抗HSV—2的藥物新靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)。 三、材料與方法: 1.實(shí)驗(yàn)材料：HSV—2病毒懸液；vero細(xì)胞株；六對siRNA(四對針對UL54基因的實(shí)驗(yàn)組siRNA： R1、R2、R3、R4；陽性組siRNA；陰性組siRNA)、帶有FAM標(biāo)記熒光的siRNA(FAM—siRNA)。 2.細(xì)胞培養(yǎng)和傳代：傳代細(xì)胞株vero細(xì)胞用含10％胎牛血清的低糖DME

10、M培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長到致密單層時(shí)，進(jìn)行消化傳代。 3.病毒增殖：vero細(xì)胞長成單層后，接種病毒，加入病毒維持液，每天觀察，80％細(xì)胞出現(xiàn)病變后，反復(fù)凍融三次，收獲病毒。 4.siRNA的設(shè)計(jì)和合成：檢索Genebank查找UL54的基因，分析其保守序列，篩選出靶序列，化學(xué)合成法合成四對實(shí)驗(yàn)組siRNA和陽性、陰性對照siRNA。 5.siRNA轉(zhuǎn)染：用FAM—siRNA進(jìn)行優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件；以獲得較高轉(zhuǎn)染率的

11、轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組的siRNA轉(zhuǎn)染。 6.病毒的感染：轉(zhuǎn)染了siRNA的六組細(xì)胞和未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的空白組細(xì)胞分別接種每孔100TCID50/100μl的HSV—2，分別于接種后12h、24h、36h、48h、60h、72h觀察紀(jì)錄細(xì)胞病變情況，并收集上清液進(jìn)行病毒滴度測定。 7.病毒滴度測定：在96孔板中進(jìn)行病毒液的系列倍比稀釋，按Reed—Mrench法計(jì)算，能引起50％培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生病變(++)的病毒最高稀釋度(TCID5

12、0)即病毒滴度。 8.MTT比色法測細(xì)胞活力：細(xì)胞傳代接種至96孔培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)染了siRNA和未轉(zhuǎn)染的空白組，于病毒感染后12h、24h、36h、48h、60h、72h進(jìn)行MTT比色法測定各組細(xì)胞的存活情況。 9.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、隨機(jī)區(qū)組方差分析，在SAS8.0系統(tǒng)完成。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 四、結(jié)果: 1.合成了實(shí)驗(yàn)用的六對雙鏈siRNA。24孔培養(yǎng)扳中，按1μ/孔Lipofect

13、amine2000，2μ/孔(40nM)的FAM—siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞孔，熒光效果最好，流式細(xì)胞學(xué)檢測轉(zhuǎn)染效率達(dá)到70-90％，轉(zhuǎn)染效果好。 2.針對UL54基因的siRNA轉(zhuǎn)染組在病毒復(fù)制早期(12-24小時(shí))即已經(jīng)出現(xiàn)明顯的病毒滴度較空白組降低；病毒復(fù)制晚期，各組病毒滴度僅稍微降低。 3.各轉(zhuǎn)染了特異性siRNA的細(xì)胞較空白組細(xì)胞病變出現(xiàn)遲，MTT比色法測得OD值較空白組高，細(xì)胞存活情況較好。 4.其中，R2

14、和R4組在病毒復(fù)制早期到晚期病毒滴度均較其它組低，細(xì)胞病變出現(xiàn)也較遲。 五、結(jié)論: 1.根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)合成的實(shí)驗(yàn)組siRNA，在合適的轉(zhuǎn)染條件下，能夠得到較好的轉(zhuǎn)染率。 2.UL54基因特異性siRNA干擾ICP27的合成，能夠抑制病毒的復(fù)制，降低子代病毒滴度，同時(shí)對宿主細(xì)胞具有保護(hù)作用，細(xì)胞病變和壞死少。這為siRNA治療HSV—2感染提供初步理論依據(jù)。 3.按照同樣的設(shè)計(jì)原則合成siRNA