Ⅰ型單純皰疹病毒糖蛋白G的表達及初步純化.pdf

1、單純皰疹病毒(herpessimplexviros，HSV)屬于皰疹病毒科，是有包膜的雙鏈DNA病毒。HSV主要通過接觸傳播，侵犯外胚層來源的組織(包括皮膚、黏膜和神經(jīng)組織)。發(fā)生在內(nèi)臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的HSV感染常常很嚴(yán)重，而且確認(rèn)困難，HSV是目前公認(rèn)的主要生物致畸因素之一，對其的檢測具有重要的臨床意義。目前普遍為臨床采用的實驗室檢查方法是酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)方法和雙抗原夾心法檢測HSV抗體(IgM和IgG)，而國內(nèi)ELISA

2、試劑盒主要用細(xì)胞培養(yǎng)的全病毒做抗原，常與其它皰疹病毒呈現(xiàn)交叉反應(yīng)，所以，抗原的質(zhì)量是影響病毒檢測靈敏度和特異性的關(guān)鍵。單純皰疹病毒有12種已命名的特異性的抗原糖蛋白，這些糖蛋白是特殊的病毒多肽，抗原性強、特異性好，可作為蛋白抗原用于檢測病毒抗體。其中HSV糖蛋白G(gG)是HSV-1與HSV-2型間差異最大的一個糖蛋白基因，因此可作為HSV型特異性血清學(xué)診斷的標(biāo)準(zhǔn)抗原。本實驗室前期已構(gòu)建了PBV220-HSV-1-gG質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染了E.

3、coliBL21，為制備HSV型特異性血清學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)抗原奠定了基礎(chǔ)，但是前期試驗結(jié)果顯示，目的蛋白的表達效果不理想。 本研究的目的和要解決的問題： 在本實驗室已構(gòu)建的工程菌PBV220-HSV-1-gG/E.coliBL21的基礎(chǔ)上，提取質(zhì)粒，對其進行轉(zhuǎn)化，通過改變不同發(fā)酵條件，從而探索對重組蛋白HSV-1-gG高效表達，并優(yōu)化表達HSV-1-gG蛋白的工程菌的發(fā)酵條件，提高目的蛋白的產(chǎn)率，探索純化目的蛋白的路徑，w

4、esternbloting鑒定目的蛋白的表達。為下一步研制重組蛋白HSV-1-gG診斷試劑盒、開發(fā)基因工程疫苗以及改善現(xiàn)有ELISA診斷試劑的靈敏性和特異性奠定基礎(chǔ)。 研究方法： (1)將實驗室保存的工程菌PBV220-HSV-1-gG/E.coliBL21菌體重新提取質(zhì)粒，制備感受態(tài)細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)化，并經(jīng)PCR和雙酶切進行鑒定。 (2)將轉(zhuǎn)化后的工程菌利用其氨芐青霉素抗性通過搖瓶培養(yǎng)、溫控誘導(dǎo)表達重組蛋白H

5、SV-1-gG。反復(fù)摸索實驗條件以實現(xiàn)對目的蛋白的高效表達，并經(jīng)Westernblotting實驗鑒定。 (3)優(yōu)化工程菌PBV220-HSV-1-gG/E.coliBL21發(fā)酵條件，將其發(fā)酵罐放大培養(yǎng)，發(fā)酵工程菌。 (4)發(fā)酵的工程菌經(jīng)超聲裂解法破裂，SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白。 (5)DEAE離子交換凝膠柱初步純化目的蛋白。 研究結(jié)果： (1)工程菌PBV220-HSV-1-g

6、G/E.coliBL21經(jīng)重新提取質(zhì)粒，用感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化后，以PCR和雙酶切實驗鑒定，證明已轉(zhuǎn)化成功。 (2)菌體經(jīng)誘導(dǎo)后，成功表達了重組蛋白HSV-1-gG。經(jīng)Westernblotting分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有明顯的目的蛋白條帶出現(xiàn)，證明工程菌經(jīng)42℃熱誘導(dǎo)表達后產(chǎn)生的蛋白的確為HSV-1-gG蛋白。 (3)經(jīng)過反復(fù)摸索，改變條件，成功上罐發(fā)酵了工程菌PBV220-HSV-1-gG/E.coliBL21。 (