單純皰疹病毒Ⅰ型包膜糖蛋白D的表達(dá)和功能檢測.pdf

1、目的:構(gòu)建包含單純皰疹病毒Ⅰ型包膜糖蛋白D的克隆載體及表達(dá)載體;將HSV-I gD基因在畢赤酵母菌GS115株中表達(dá),挑選穩(wěn)定高效表達(dá)株,建立酵母表達(dá)系統(tǒng);將表達(dá)產(chǎn)物作為包被抗原,建立一種特異性和靈敏性較高、簡便、快速的ELISA方法,從而為快速準(zhǔn)確地診斷、治療HSV感染和疫苗的研制與開發(fā)奠定基礎(chǔ).方法：根據(jù)GeneBank中HSV-I gD的保守序列，設(shè)計引物，通過PCR擴(kuò)增包膜糖蛋白gD全基因，將目的基因先克隆至于pMD18T載體上

2、，建立克隆載體，測序并用BLAST軟件進(jìn)行同源序列比較，觀察核酸以及氨基酸變異情況;目的基因經(jīng)雙酶切與酵母表達(dá)載體pGAPZαA連接，測序以確定其序列，利用TmPred和Swiss-Model軟件預(yù)測其跨膜區(qū)及三維結(jié)構(gòu)，分析氨基酸變異及α信號肽與組氨酸尾的表達(dá)對HSV-I gD蛋白抗原性的影響;用LiCl法將線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入畢赤酵母GS115株，建立酵母表達(dá)系統(tǒng);表達(dá)產(chǎn)物以Western Blot進(jìn)行鑒定，將重組抗原包被ELI