與Ⅰ型單純皰疹病毒感染相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)抑制蛋白HIRRP的功能研究.pdf

1、病毒和宿主細(xì)胞間的相互作用充分體現(xiàn)了自然界生物物種間相互斗爭又相互依存的關(guān)系。病毒與宿主細(xì)胞間的相互作用是復(fù)雜而廣泛的。在病毒感染細(xì)胞的過程中，病毒能與宿主細(xì)胞內(nèi)的多種組分發(fā)生作用，進(jìn)而導(dǎo)致宿主細(xì)胞的蛋白表達(dá)譜發(fā)生改變，而這些差異蛋白正是被感染細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生一系列生物效應(yīng)的分子基礎(chǔ)。單純皰疹病毒Ⅰ型(HSVI)是一種具有較強(qiáng)傳染性的雙鏈DNA病毒，在人群中感染率很高。本研究的前期工作通過2-DE差異蛋白電泳在HSVI感染后的人肝L02細(xì)胞中

2、，篩選并鑒定出表達(dá)明顯升高的差異蛋白分子之一Unnamed protein(UP)。但目前人們對它的認(rèn)識幾乎為“零”，還沒有任何關(guān)于UP蛋白功能的研究工作被報道。
　　 本課題的研究重點是分析HSVI病毒感染L02細(xì)胞后表達(dá)升高的差異蛋白UP在HSVI病毒與細(xì)胞相互作用過程中的功能意義。課題以病毒學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)等實驗為基礎(chǔ)，結(jié)合報告基因、酵母雙雜交、免疫共沉淀和凝膠電泳遷移率變更實驗(EMSA)等研究方法，對

3、UP的功能特性和與其相互作用的細(xì)胞內(nèi)蛋白進(jìn)行了初步研究。首先，通過Northern Blot雜交、Real-time PCR和Western Blot雜交實驗，分析并證實了UP蛋白的表達(dá)與HSVI的感染具有密切聯(lián)系。其次，通過UP-GFP融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的熒光定位實驗，發(fā)現(xiàn)正常狀態(tài)下UP蛋白定位于細(xì)胞胞漿，而HSVI感染后，部分UP蛋白能實現(xiàn)從胞漿向胞核的轉(zhuǎn)移，且該現(xiàn)象在不同類型的細(xì)胞中并無差異；再次，通過空斑形成單位實驗(PFU)發(fā)現(xiàn)

4、上調(diào)UP蛋白的表達(dá)能抑制HSVI病毒的活性，而UP蛋白的低表達(dá)則能逆轉(zhuǎn)UP對HSVI病毒的抑制作用；另外，CAT報告基因?qū)嶒炞C明，UP蛋白對HSVI立早、早期和晚期某些典型基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性具有抑制作用，且發(fā)揮該抑制作用的功能結(jié)構(gòu)域主要位于UP蛋白N末端大約1-80位氨基酸的區(qū)域；并且，應(yīng)用酵母雙雜交實驗，篩選到與UP蛋白在細(xì)胞內(nèi)相互作用的下游分子之一：激活轉(zhuǎn)錄因子5(activating transcription factor 5，

5、ATF5)；更進(jìn)一步通過免疫共沉淀實驗證實UP與ATF5兩者在真核細(xì)胞中存在蛋白一蛋白間的相互作用；接下來，應(yīng)用EMSA實驗發(fā)現(xiàn)UP蛋白與ATF5經(jīng)典的DNA結(jié)合位點CRE-DNA序列無直接結(jié)合效應(yīng)，提示UP可能是作為一個轉(zhuǎn)錄輔抑制因子通過與ATF5產(chǎn)生相互作用，進(jìn)而影響ATF5對下游靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，結(jié)果表現(xiàn)為：UP蛋白對HSVI病毒活性的抑制及產(chǎn)生一系列特定的生物學(xué)效應(yīng)。
　　 通過對UP蛋白功能的初步研究，綜合分析以上

6、實驗結(jié)果，我們初步推測：作為HSVI感染后細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)的應(yīng)激分子，UP蛋白有可能通過細(xì)胞輔抑制因子復(fù)合物的形式調(diào)控了某些特殊基因的轉(zhuǎn)錄，以使感染細(xì)胞對病毒的刺激產(chǎn)生適宜性應(yīng)答。由此我們也嘗試將Unnamed Protein更名為HSVI感染反應(yīng)抑制蛋白(HSVI Infection Response Repress Protein，HIRRP)，簡稱HIRRP。以上研究結(jié)果在一定程度上提示了一種病毒與細(xì)胞輔抑制因子復(fù)合物相互作用的新方式，