與Ⅰ型單純皰疹病毒感染相關的細胞內反應抑制蛋白HIRRP的功能研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、病毒和宿主細胞間的相互作用充分體現(xiàn)了自然界生物物種間相互斗爭又相互依存的關系。病毒與宿主細胞間的相互作用是復雜而廣泛的。在病毒感染細胞的過程中,病毒能與宿主細胞內的多種組分發(fā)生作用,進而導致宿主細胞的蛋白表達譜發(fā)生改變,而這些差異蛋白正是被感染細胞內產生一系列生物效應的分子基礎。單純皰疹病毒Ⅰ型(HSVI)是一種具有較強傳染性的雙鏈DNA病毒,在人群中感染率很高。本研究的前期工作通過2-DE差異蛋白電泳在HSVI感染后的人肝L02細胞中

2、,篩選并鑒定出表達明顯升高的差異蛋白分子之一Unnamed protein(UP)。但目前人們對它的認識幾乎為“零”,還沒有任何關于UP蛋白功能的研究工作被報道。
   本課題的研究重點是分析HSVI病毒感染L02細胞后表達升高的差異蛋白UP在HSVI病毒與細胞相互作用過程中的功能意義。課題以病毒學、細胞生物學、分子生物學和免疫學等實驗為基礎,結合報告基因、酵母雙雜交、免疫共沉淀和凝膠電泳遷移率變更實驗(EMSA)等研究方法,對

3、UP的功能特性和與其相互作用的細胞內蛋白進行了初步研究。首先,通過Northern Blot雜交、Real-time PCR和Western Blot雜交實驗,分析并證實了UP蛋白的表達與HSVI的感染具有密切聯(lián)系。其次,通過UP-GFP融合蛋白在細胞內的熒光定位實驗,發(fā)現(xiàn)正常狀態(tài)下UP蛋白定位于細胞胞漿,而HSVI感染后,部分UP蛋白能實現(xiàn)從胞漿向胞核的轉移,且該現(xiàn)象在不同類型的細胞中并無差異;再次,通過空斑形成單位實驗(PFU)發(fā)現(xiàn)

4、上調UP蛋白的表達能抑制HSVI病毒的活性,而UP蛋白的低表達則能逆轉UP對HSVI病毒的抑制作用;另外,CAT報告基因實驗證明,UP蛋白對HSVI立早、早期和晚期某些典型基因的轉錄調控活性具有抑制作用,且發(fā)揮該抑制作用的功能結構域主要位于UP蛋白N末端大約1-80位氨基酸的區(qū)域;并且,應用酵母雙雜交實驗,篩選到與UP蛋白在細胞內相互作用的下游分子之一:激活轉錄因子5(activating transcription factor 5,

5、ATF5);更進一步通過免疫共沉淀實驗證實UP與ATF5兩者在真核細胞中存在蛋白一蛋白間的相互作用;接下來,應用EMSA實驗發(fā)現(xiàn)UP蛋白與ATF5經典的DNA結合位點CRE-DNA序列無直接結合效應,提示UP可能是作為一個轉錄輔抑制因子通過與ATF5產生相互作用,進而影響ATF5對下游靶基因的轉錄調控功能,結果表現(xiàn)為:UP蛋白對HSVI病毒活性的抑制及產生一系列特定的生物學效應。
   通過對UP蛋白功能的初步研究,綜合分析以上

6、實驗結果,我們初步推測:作為HSVI感染后細胞內出現(xiàn)的應激分子,UP蛋白有可能通過細胞輔抑制因子復合物的形式調控了某些特殊基因的轉錄,以使感染細胞對病毒的刺激產生適宜性應答。由此我們也嘗試將Unnamed Protein更名為HSVI感染反應抑制蛋白(HSVI Infection Response Repress Protein,HIRRP),簡稱HIRRP。以上研究結果在一定程度上提示了一種病毒與細胞輔抑制因子復合物相互作用的新方式,

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