單純皰疹病毒Ⅰ型體外感染人口腔上皮細胞的初步探討.pdf

1、牙周病是人類常見病之一，是成人牙齒喪失的主要原因。牙周炎的發(fā)病機制一直是近年來牙周病學領(lǐng)域的研究熱點。眾所周知，牙菌斑為牙周病的始動因子，它與牙石，食物嵌塞，驗創(chuàng)傷等局部因素和全身因素共同作用引起牙周病。但細菌致病學說并不能很好地解釋牙周病的部位特異性以及間斷爆發(fā)性等問題。同時基因檢測等分子生物學技術(shù)問世和不斷發(fā)展，許多學者研究發(fā)現(xiàn)在牙周炎患者病變位點的齦溝液和牙齦組織中?？蓹z測到皰疹病毒，尤其是單純皰疹病毒I型。因此提出單純皰疹病毒感

2、染與各型牙周炎具有一定相關(guān)關(guān)系.單純皰疹病毒在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中又是通過怎樣的途徑發(fā)揮作用的?？紤]到病毒感染宿主的第一步便是病毒吸附進入宿主細胞，而人口腔上皮細胞又是人類口腔中先天性防御系統(tǒng)的第一道屏障，因此在體外建立一個單純皰疹病毒Ⅰ型感染人口腔上皮細胞的實驗?zāi)Ｐ途途哂衅涮厥獾囊馑?。本研究擬在體外大量擴增獲得HSV-1，再用標化的病毒直接感染人口腔上皮細胞KB細胞系，建立HSV-1體外感染人口腔上皮細胞模型。并通過間接感染的方法“轉(zhuǎn)移

3、感染”Vero細胞，利用倒置顯微鏡、透射電鏡技術(shù)和PCR技術(shù)對模型建立結(jié)果進行鑒定. 實驗一 HSV-1體外感染人口腔上皮細胞實驗?zāi)Ｐ偷慕⒛康脑隗w外建立HSV-1感染人口腔上皮細胞實驗?zāi)Ｐ停⑦\用一定方法進行鑒定。 材料和方法在體外利用Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)擴增HSV-1，并利用噬斑計數(shù)法測定病毒滴度(PFU/ml)，用此病毒分別以MOI為0.5PFU/cell、1.0 PFU/cell、3.0 PFU/cel

4、l感染人口腔上皮細胞KB細胞，并以正常Vero細胞上清液代替HSV-1病毒液作為空白對照。分別于0h、24h、48h在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，于感染后48h收集細胞，制成超薄切片在透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)。并用PCR技術(shù)檢測感染后KB細胞基因組中是否包含HSV-1特異性的糖蛋白D基因片段。 結(jié)果：在體外通過Vero細胞成功的擴增出大量HSV-1，并將其滴定標化為106PFU/ml。HSV-1體外感染KB細胞后于24h，48h

5、在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，未觀察到明顯的細胞病變效應(yīng)。透射電鏡下，KB細胞核內(nèi)及胞漿內(nèi)均未見HSV-1病毒顆粒。而KB細胞基因組DNA經(jīng)PCR擴增，凝膠電泳后可見一位于709 bp位置的陽性條帶，與預(yù)測結(jié)果一致。 結(jié)論：HSV-1體外感染人口腔上皮KB細胞實驗?zāi)Ｐ徒?。KB細胞為HSV-1的非允許性細胞，HSV-1感染KB細胞后可能形成轉(zhuǎn)化性感染或潛伏性感染。 實驗二KB細胞的上清液對Vero細胞的“轉(zhuǎn)移感染”及鑒定目

6、的通過“轉(zhuǎn)移感染”的間接方法將前述實驗中KB細胞的上清液感染對HSV-1敏感的Vero細胞，以此檢驗HSV-1是否成功感染人口腔上皮KB細胞。 材料和方法收集實驗一模型中不同MOI組HSV-1體外感染KB細胞48h后的培養(yǎng)上清，并以之感染HSV-1的允許性細胞Vero細胞。分別于0h、24h、48h在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，于感染后48h收集細胞，制成超薄切片在透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)和病毒形態(tài)。并在“轉(zhuǎn)移感染”48h后計算

7、細胞病變率。 結(jié)果：倒置顯微鏡下，Vero細胞“轉(zhuǎn)移感染”24h時可觀察到細胞病變出現(xiàn)；48h時細胞病變率上升。掃描電鏡下Vero細胞核內(nèi)可見大量大小均一的典型HSV-1顆粒。通過對細胞病變率進行統(tǒng)計，得知各滴度組“轉(zhuǎn)移感染”后Vero細胞病變率有顯著性差異。 結(jié)論： KB細胞中潛伏的病毒被活化并在Vero細胞中產(chǎn)生了感染性病毒顆粒，證明了HsV-1可在體外感染口腔上皮細胞，并表達其基因。 綜上所述，本研究利用v