皺瘤海鞘抗單純皰疹病毒I型的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:海鞘類(lèi)動(dòng)物(Ascidians)屬脊索動(dòng)物門(mén)的尾索動(dòng)物亞門(mén),廣泛分布于世界各個(gè)海域中,自沿海水域至深海海底皆有其棲息,種類(lèi)繁多,在自然界中已知有1500余種。海鞘在進(jìn)化上所處的特殊地位,受到動(dòng)物學(xué)者、進(jìn)化論學(xué)者和內(nèi)分泌學(xué)者的高度關(guān)注,已成為科學(xué)工作者競(jìng)相研究的熱點(diǎn)之一。20世紀(jì)80年代以來(lái),人們已發(fā)現(xiàn)海鞘類(lèi)生物中含有肽類(lèi)、生物堿類(lèi)、聚醚類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、萜類(lèi)等多種化合物,它們大部分具有抗腫瘤、抗病毒、抗微生物以及免疫調(diào)節(jié)、生物催化等

2、生理活性。
　　 我國(guó)南海有著豐富的海鞘資源,目前已發(fā)現(xiàn)有66種,皺瘤海鞘[Styela plicata(lesueur)]是其中的一種。皺瘤海鞘是一種可以食用的海鞘,國(guó)內(nèi)外有關(guān)其營(yíng)養(yǎng)成分研究的報(bào)道很多,如氨基酸、多糖等。近年來(lái),我們已經(jīng)對(duì)其進(jìn)行了基礎(chǔ)的抗病毒實(shí)驗(yàn)研究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示其在體內(nèi)外對(duì)乙肝病毒都有良好抑制作用,提示其具有一定的抗病毒活性。為了進(jìn)一步研究皺瘤海鞘的抗病毒藥效,我們研究了皺瘤海鞘醇提取物對(duì)同是DNA病毒的單純

3、皰疹病毒Ⅰ型(herpes simlexvirus types-Ⅰ,HSV-Ⅰ)的抗病毒作用,并對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行初步研究,為新型的抗HSV-Ⅰ藥物的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。
　　 方法:本課題可分為以下三個(gè)部分:
　　 1.皺瘤海鞘醇提物體外抗HSV-Ⅰ型藥效學(xué)研究
　　 本研究以HSV-Ⅰ感染非洲綠猴腎細(xì)胞(vero細(xì)胞)為細(xì)胞模型,探討了皺瘤海鞘醇提物體外抗HSV-Ⅰ活性的藥效學(xué)作用。首先是應(yīng)用MTT法檢測(cè)皺瘤海鞘

4、醇提物對(duì)細(xì)胞的毒性作用,將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期vero細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后接種于96孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)24 h,形成單層細(xì)胞后棄培養(yǎng)液,加入對(duì)倍稀釋成6個(gè)濃度的皺瘤海鞘醇提物(10,5,2.5,1.25,0.63,0.32 mg/mL),每濃度4個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)4個(gè)正常對(duì)照孔,每天使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況,繼續(xù)培養(yǎng)3 d后,記錄細(xì)胞病變情況。每孔加入MTT溶液20μL,于37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后,每孔加二甲基亞砜150μL,充分混勻后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于波長(zhǎng)

5、570nm處測(cè)定各組細(xì)胞的吸光度,以反映皺瘤海鞘醇提取物對(duì)vero細(xì)胞增殖活性的影響；然后以不同濃度的皺瘤海鞘醇提物與病毒混合后直接感染細(xì)胞,每一濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)陽(yáng)性藥ACV對(duì)照組、正常細(xì)胞對(duì)照組及病毒對(duì)照組,置37℃,5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h,每天使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況,當(dāng)病毒對(duì)照病變達(dá)75％～100％時(shí),記錄細(xì)胞病變情況,并使用用MTT法測(cè)定波長(zhǎng)570nm處各組細(xì)胞的吸光度,按Reed-Muench法分別計(jì)算皺瘤海

6、鞘醇提物和ACV對(duì)vero細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度(TC50)、皺瘤海鞘醇提物和ACV的半數(shù)抑制病毒有效劑量(IC50)和治療指數(shù)(TI)。
　　 2.皺瘤海鞘醇提取物體內(nèi)抗HSV-Ⅰ的實(shí)驗(yàn)研究
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究皺瘤海鞘醇提物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單純皰疹病毒局部感染和全身感染的治療效果,探討了其在體內(nèi)抗HSV-Ⅰ藥效作用。局部感染模型為單純皰疹性角膜炎,選用健康豚鼠20只,按角膜劃痕方法,以1％戊巴比妥鈉生理鹽水腹腔注射7.5ml/

7、kg麻醉,用1ml注射器針頭井字劃痕(深度為角鞏緣微有滲血為度),滴加1滴HSV-Ⅰ病毒培養(yǎng)液,閉眼按摩15-30秒,2天后以1％熒光素鈉生理鹽水溶液染色,裂隙燈顯微鏡下觀察角膜病變(角膜上皮點(diǎn)狀、樹(shù)枝狀、地圖狀著色及基質(zhì)混濁)范圍。按病變的深淺、形態(tài)、嚴(yán)重程度搭配分為3組,每組6對(duì)(12只眼),分別給予生理鹽水、阿昔洛韋、皺瘤海鞘醇提物滴眼處理,3組均每天5次滴眼,每次1滴,連續(xù)15天,每隔3天用1％熒光素鈉生理鹽水溶液染色,裂隙燈顯

8、微鏡下觀察記錄病情變化,以角膜病變?cè)u(píng)分作為指標(biāo)；全身感染模型為腹腔注射病毒滴度為100 TCID50/0.1ml的病毒稀釋液0.4ml,分別給予皺瘤海鞘醇提物或阿昔洛韋進(jìn)行治療,另設(shè)正常對(duì)照組和病毒對(duì)照組。持續(xù)給藥7天,以死亡率、體重、肝臟組織病理形態(tài)學(xué)為指標(biāo),評(píng)價(jià)了皺瘤海鞘醇提物對(duì)HSV-Ⅰ全身感染小鼠的治療作用。
　　 3.皺瘤海鞘醇提物抗HSV-Ⅰ作用機(jī)理的初步研究
　　 運(yùn)用vero細(xì)胞體外藥效篩選模型,采用細(xì)胞

9、病變效應(yīng)CPE法和MTT兩種測(cè)定方法,三種不同的加藥方式在細(xì)胞水平上探討皺瘤海鞘乙醇提取物抗HSV-Ⅰ的作用機(jī)理。以不同劑量的皺瘤海鞘乙醇提取物作用于病毒復(fù)制周期的不同環(huán)節(jié),探索其在宿主細(xì)胞內(nèi)影響病毒復(fù)制過(guò)程的作用機(jī)理,揭示了皺瘤海鞘醇提物對(duì)HSV-Ⅰ的直接殺傷作用、對(duì)HSV-Ⅰ吸附的影響和對(duì)HSV-Ⅰ生物合成的抑制作用。
　　 結(jié)果:采用MTT法測(cè)得皺瘤海鞘醇提物對(duì)vero細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度(TC50)為6.868mg/ml,

10、而ACV對(duì)vero細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度(TC50)為0.254mg/ml,藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)選擇皺瘤海鞘醇提物的最大濃度為2mg/ml,阿昔洛韋的最大濃度為0.04mg/ml,所對(duì)應(yīng)的細(xì)胞存活率均大于80％；MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明皺瘤海鞘醇提物對(duì)HSV-Ⅰ所致的細(xì)胞病變有明顯的抑制作用,半數(shù)抑制病毒有效劑量(IC50)為0.230 mg/mL,治療指數(shù)(TI)為29.86。ACV的IC50為0.008 mg/mL,TI為31.75。兩者效果相當(dāng)。<

11、br>　　 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,皺瘤海鞘醇提物滴眼第3天到15天,角膜病變迅速好轉(zhuǎn),非參數(shù)檢驗(yàn)的Kruskal-Wallis H法檢驗(yàn)結(jié)果顯示第3天到15天治療組平均秩和低于病毒對(duì)照組,各治療組整體比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),進(jìn)而分別進(jìn)行給藥第三天、第六天、第九天、十二天、十五天時(shí),皺瘤海鞘組與病毒對(duì)照組兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn),結(jié)果提示從第3天到9天皺瘤海鞘組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與病毒對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物角膜評(píng)分均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P值均小于0

12、.0167),皺瘤海鞘組動(dòng)物愈合時(shí)間短,角膜病變程度輕。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn),給藥第12、15天各用藥組與對(duì)照組的平均秩和差距縮小,皺瘤海鞘組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與不用藥組的病毒對(duì)照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物角膜評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P值均大于0.0167),這可能是對(duì)照組豚鼠部分角膜病變的自然愈合所致。初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)皺瘤海鞘醇提物的治療,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物角膜病變明顯減輕,皺瘤海鞘醇提物對(duì)單純皰疹病毒性角膜炎較為敏感,在體內(nèi)具有一定抗病毒活性,對(duì)實(shí)驗(yàn)性單純皰疹性角膜炎

13、有明顯的療效。
　　 全身感染模型的實(shí)驗(yàn)中,皺瘤海鞘組小鼠死亡率比病毒對(duì)照組低,與病毒對(duì)照組比較,皺瘤海鞘組的死亡率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。此外,皺瘤海鞘組小鼠的體重也有不同程度的增加,重復(fù)測(cè)量方差分析顯示,皺瘤海鞘醇提物治療的小鼠,給藥第六天的小鼠體重與病毒對(duì)照組相比,差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。從病理切片結(jié)果顯示,與病毒對(duì)照組相比,皺瘤海鞘組小鼠其肝臟病理?yè)p害的減輕比較明顯,說(shuō)明皺瘤海鞘能有效地減輕感染小鼠肝臟

14、的病理?yè)p害。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同濃度的皺瘤海鞘醇提物對(duì)HSV-Ⅰ病毒都有顯著的直接殺傷作用,濃度為2mg/ml時(shí),累積存活率為96.44％,抑制HSV-Ⅰ所致細(xì)胞病變的效果隨濃度增加而增強(qiáng),各濃度組的細(xì)胞吸光值與病毒對(duì)照組的吸光值比較,差異均具有顯著性(P<0.01)；高濃度的皺瘤海鞘醇提物對(duì)HSV-Ⅰ病毒的復(fù)制有一定的影響,低濃度對(duì)其影響不大,最高濃度2mg/mL時(shí),細(xì)胞累積存活百分率為74.52％,各濃度組的吸光值與病毒

15、對(duì)照組的吸光值比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)HSV-Ⅰ病毒吸附的影響作用較弱,2 mg/ml時(shí),其細(xì)胞累積存活率達(dá)只有40.01％,當(dāng)皺瘤海鞘濃度大于0.5mg/ml時(shí),吸光值與病毒對(duì)照組的吸光值比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明了高濃度的皺瘤海鞘對(duì)病毒的吸附有一定的作用。
　　 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了皺瘤海鞘醇提物體外抗HSV-Ⅰ藥效作用理想,隨著濃度增加其藥效作用就越強(qiáng),具有良好的量效關(guān)系。與陽(yáng)性對(duì)

16、照物ACV相比,皺瘤海鞘醇提物對(duì)細(xì)胞毒性小,治療指數(shù)高,對(duì)HSV-Ⅰ病毒都有顯著的直接殺傷作用,高濃度的皺瘤海鞘醇提物對(duì)病毒的吸附、生物合成有一定的影響。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的局部模型和全身感染模型中,皺瘤海鞘均有一定的抗病毒作用,實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果和特征都符合藥物藥效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)要求,提示皺瘤海鞘醇提物可以進(jìn)一步應(yīng)用于全面的抗單純皰疹病毒實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)工作。
　　 本次課題再次提示我們,皺瘤海鞘是天然產(chǎn)物,具有低毒、高效的特點(diǎn),不同于常用合成類(lèi)抗