皺瘤海鞘抗乙肝病毒有效部位的體外實驗研究.pdf

1、目前對海鞘的開發(fā)研究主要集中于抗腫瘤或抗病毒新化合物的分離篩選、合成及其結(jié)構(gòu)改造，但對于海鞘抗乙型肝炎病毒的研究尚未見報道。本課題根據(jù)海鞘中有關(guān)生物堿和皂苷的報道，利用生物堿和皂苷的提取方案，獲取了皺瘤海鞘中的生物總堿及皂苷部位，利用轉(zhuǎn)染HBV的HepG2 2.2.15細胞作為體外藥效學(xué)模型，對新鮮皺瘤海鞘[Styela plicata(lesueur)]生物總堿及皂苷部位進行體外抗乙肝病毒試驗，以考察其藥效，并對已獲得的皺瘤海鞘抗乙肝

2、病毒有效部位群建立了高效液相(HPLC)指紋圖譜，以便對其原料來源及其制劑進行質(zhì)量控制。 本課題可分為以下三個部分： 1皺瘤海鞘有效部位的分離與鑒定我們采取生物總堿及皂苷的提取方案分別從新鮮的皺瘤海鞘中提取得到生物總堿部位及正丁醇部位。主要的分離過程是：取去內(nèi)臟皺瘤海鞘，用95％乙醇(用H<,2>SO<,4>調(diào)節(jié)pH至3)浸泡24h，回流提取2小時，溶液過濾，濾液減壓回收乙醇，水浴蒸干得浸膏，浸膏用1％H<,2>SO<,4

3、>溶解，用等體積氯仿萃取除酯，余液用10％氨水調(diào)節(jié)pH值至9.5，堿水液用等體積氯仿萃取，氯仿層水浴蒸干，得生物總堿部位。從皺瘤海鞘醇提物中萃取得到正丁醇部位(S)，利用硅膠柱層析技術(shù)對皺瘤海鞘正丁醇部位進行系統(tǒng)分離，用氯仿：甲醇不同比例依次洗脫得到．Fr-S1，F(xiàn)r-S2，F(xiàn)r-S3和Fr-S4部位，由于Fr-S3有較強的抑制病毒的活性，且量較多，故從Fr-S3中純化得到HQS3化合物。 2 皺瘤海鞘有效部位的體外藥效學(xué)試驗運

4、用HepG2 2.2.15細胞體外藥效篩選模型，對生物總堿部位及正丁醇各部位進行了藥效篩選。通過藥效學(xué)試驗及MTT結(jié)果可知：生物總堿在體外能顯著抑制HepG2 2.2.15細胞分泌HBsAg和HBeAg，其IC<,50>分別是1.110mg/ml，1.715mg/ml，而且其對細胞基本沒有毒性，安全性高。經(jīng)實驗表明，正丁醇部位(S)、Fr-S2、Fr-S3均有一定的抗乙肝病毒的效果，F(xiàn)r-S3部位表現(xiàn)出較強的抑制HepG2 2.2.15

5、細胞分泌HBsAg、HBeAg的藥理活性，故對該部分進一步采用硅膠柱層析分離，得到化合物HQS3，其在0.125mg/ml低濃度下也有較強的抑制細胞分泌HBsAg及HBeAg的藥理活性。根據(jù)計算，HQS3抑制HBsAg的半數(shù)有效濃度為0.159mg/ml，抑制HBeAg的半數(shù)有效濃度為0.468mg/ml。該化合物在高濃度下表現(xiàn)出一定的毒性，但在所測濃度中，細胞破壞率未達到50％，故其半數(shù)毒性濃度TC<,50>大于0.5mg/ml，其抑

6、制HBsAg及HBeAg治療指數(shù)T1分別為大于3.14和1.07。根據(jù)其治療指數(shù)可以認為化合物對抑制2.2.15細胞分泌HBsAg、HBeAg有一定效果，且細胞毒性不大，為開發(fā)抗新型高效低毒的乙肝藥物提供了理論依據(jù)。 3 皺瘤海鞘抗乙肝病毒有效部位指紋圖譜的研究本課題利用HPLC技術(shù)建立了皺瘤海鞘有效部位指紋圖譜的分析方法。該方法是以從皺瘤海鞘中提取分離得到有效單體成分-多肽Sub(氨基酸序列為Ser-Ser-Leu-Ser-L

7、ys-Ala-Ala)為基礎(chǔ)，以皺瘤海鞘藥材中抗乙肝有效部位作為質(zhì)控對象，并利用現(xiàn)代儀器分析技術(shù)進行分析。試驗采用線性梯度洗脫方式，該方法色譜條件容易控制，各個峰之間能夠得到較好的分離，分析結(jié)果具有較好的試驗精密度和試驗重現(xiàn)性。 在該色譜條件下，皺瘤海鞘有效部位的HPLC譜可以檢出13個共有峰。色譜圖中S峰即為Sub的色譜峰，即從皺瘤海鞘中提取分離得到的一種多肽單體成分。以S峰作為基準，其它各峰與之相對照，分別得到各峰的相對保留

8、時間值和峰面積比值，可基本反映各個HPLC色譜峰間的關(guān)系。在10份皺瘤海鞘供試品溶液的HPLC圖譜中，13個色譜峰的相對保留時間均比較穩(wěn)定，各特征峰平均相對保留時間分別為0.95(1)、1.00(S)、1.21(3)、1.28(4)、1.54(5)、1.61(6)、1.71(7)、1.78(8)、1.85(9)、1.98(10)、2.05(11)、2.10(12)、2.28(13)，相對偏差小于3％，可以確定為主要峰作為定性鑒別的指標(biāo)參