針對HBV S基因的反義鎖核酸抗乙肝病毒表達的體外實驗研究.pdf

1、目的：以HepG2．2．15細胞為實驗模型，研究陽離子脂質體介導的針對HBV S基因反義鎖核苷酸片段抗乙肝病毒的療效，為研究和開發(fā)新型抗乙肝藥提供實驗依據。 方法： 1、HepG2．2．15細胞的鑒定：分別用PCR、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和免疫細胞化學法對HepG2．2．15 HBV亞型、活性及功能進行鑒定。 2、篩選陽離子脂質體轉染劑量及初步確定HepG2．2．15細胞的轉染效率：分別用2．5、5、7．5

2、和10μL/mL脂質體轉染HepG2．2．15細胞；觀察其分泌HBsAg、HBeAg量；并用MTT法檢測脂質體對細胞的毒性；及凋亡染色試劑檢測細胞凋亡情況。用上述四個濃度的陽離子脂質體包裹pEGFP-N1轉染HepG2．2．15細胞48h后在熒光顯微鏡下觀察細胞表達綠色熒光蛋白的量，以確定細胞是否易感及轉染效率的高低。 3、ASODN的設計：設計并合成互補于HBV mRNA S基因翻譯起始位點（155～165nt）的11聚反義寡

3、脫氧核苷酸（ASODN），分別進行LNA修飾、磷酸全硫代修飾，同時設計合成與HBV基因的無關序列作為對照。 4、進一步篩選ASODN/陽離子脂質體的比例：以5和7．5μL/mL脂質體包裹PSODN觀察其分泌HBsAg、HBeAg量；并用MTT法檢測PSODN/脂質體復合物對細胞的毒性；凋亡染色試劑檢測細胞凋亡情況。 5、檢測LNA體外抗核酶的穩(wěn)定性：用核酸外酶切對LNA、脂質體包裹的LNA、PSODN和脂質體包裹的PSO

4、DN進行酶切，將酶切產物進行電泳后觀察結果，判斷修飾后的ASODN及脂質體包裹后ASODN體外抗酶切的穩(wěn)定性。 6、LNA體外抗HBV活性：將脂質體包裹LNA、未修飾ASODN、無關ODN及脂質體對照、拉米夫定及空白對照分別作用HepG2．2．15細胞。每隔48h收集細胞上清，連續(xù)10滅檢測其分泌HBsAg、HBeAg量及熒光定量PCR法檢測細胞培養(yǎng)上清中HBV DNA含量的變化。并用MTT法檢測LNA/脂質體復合物對細胞的毒性

5、；及凋亡染色試劑檢測細胞凋亡情況。 結果： 1、培養(yǎng)HepG2．2．15細胞上清中含乙肝病毒DNA，經PCR擴增結果與HBV基因ayw亞型相符，該細胞能持續(xù)分泌HBsAg、HBeAg及病毒顆粒，免疫組化HBsAg呈陽性。 2、陽離子脂質體轉染HepG2．2．15細胞時濃度宜小于7．5μL/mL，陽離子脂質體能抑制細胞分泌HBsAg、HBeAg，對該細胞具有一定的毒性作用（與空白對照組比較P<0．05），能誘導部分

6、細胞凋亡。HepG2．2．15細胞對陽離子脂質體介導的pEGFP-N1易感，能表達綠色熒光蛋白，但轉染效率較低（<23％）。 3、ASODN與陽離子脂質體的比例宜為3μ/5μL/mL。若脂質體與PSODN濃度過大，細胞分泌HBsAg、HBeAg均受抑制，細胞存活率低，凋亡現(xiàn)象較多見。 4、經LNA修飾的ASODN在體外有良好的抗酶切穩(wěn)定性。而PSODN及脂質體包裹后PSODN不能抵抗酶切作用。 5、針對HBV S

7、片段翻譯起始區(qū)的各種修飾的ASODN均具抑制細胞分泌HBsAg、HBeAg（與空白對照組比較P<0．05），其中LNA組對HBsAg、HBeAg的抑制效最高達67．7％、59．7％，優(yōu)于拉米夫定組。FQ-PCR結果顯示細胞培養(yǎng)上清中HBV DNA均為陽性，LNA組抑制HBV DNA達63．3％（與空白對照組比較P<0．05）與HBsAg、HBeAg結果相符。 6、LNA對HepG2．2．15細胞毒性作用較小，與脂質體對照組無明顯

8、差異。LNA能誘導HepG2．2．15細胞凋亡。 結論： 1、HepG2．2．15細胞具有良好的HBV表達活性，為篩選抗HBV藥物的良好體外模型。 2、陽離子脂質體抑制HepG2．2．15細胞分泌HBsAg、HBeAg，對細胞有一定的毒性作用，并能誘導細胞凋亡。HepG2．2．15細胞對陽離子脂質體介導基因的轉染易感。 3、經LNA修飾的ASODN有良好的抗酶切作用。 4、針對HBV S片段翻譯起