優(yōu)化選擇的串聯(lián)序列amiRNA表達(dá)載體抗乙肝病毒的研究.pdf

1、RNA干擾為治療人類疾病提供了一個很有前景盼方法。前期已有一些學(xué)者對于RNAi抗HBV做過研究,但是每個研究小組設(shè)計的siRNA分子對病毒的抑制效果有明顯的差異,因此還需在HBV的干擾靶點(diǎn)上做大量的工作;另外大多研究進(jìn)行的都是siRNA的瞬時轉(zhuǎn)染,未構(gòu)建穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體系,不能觀察清除HBV RNA的遠(yuǎn)期效果;目前臨床應(yīng)用的抗病毒藥物也都需要進(jìn)行長期治療,包括干擾素、核苷酸類似物,RNA干擾的作用亦需持久。
　　 病毒基因突變是RN

2、A干擾抗病毒失敗的重要原因,針對病毒可逃逸RNAi作用的特點(diǎn),我們設(shè)計了可在體內(nèi)同時表達(dá)兩個microRNA,靶向不同位點(diǎn)的串聯(lián)序列amiRNA。即便是病毒一個基因位點(diǎn)的突變就可以逃逸siRNA,而并不能逃逸miRNA的干擾作用。miRNA在體內(nèi)之所以能廣泛存在并發(fā)揮作用,是因?yàn)樗奶攸c(diǎn)是只要骨架與靶RNA相同,單一一個位點(diǎn)的變化不會影響其發(fā)揮作用。目前對于乙肝病毒的研究已從最初的化學(xué)合成siRNA、shRNA質(zhì)粒載體等向應(yīng)用性較強(qiáng)的m

3、icroRNA的研究過渡。
　　 盡管有學(xué)者用化學(xué)合成的多個siRNA同時作用于一個細(xì)胞,證實(shí)了靶向多個區(qū)域基因的可行性,但其為劑量依賴性的,需經(jīng)常向體內(nèi)注入siRNA。通過質(zhì)粒等載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)miRNA或siRNA不僅經(jīng)濟(jì)方便,還可進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,使小干擾RNA持續(xù)表達(dá),延長對目的基因的抑制時間。質(zhì)粒載體能介導(dǎo)更長期的干擾效果,而過多的質(zhì)粒載體可能對細(xì)胞造成一定的影響。串聯(lián)序列表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)就在于只需導(dǎo)入一個質(zhì)粒載體就可發(fā)揮作

4、用。amiRNA使得導(dǎo)入的外源性基因在體內(nèi)自然形成miRNA成為可能,并可同時表達(dá)多條miRNA。
　　 有學(xué)者利用polⅡ啟動子表達(dá)多個串聯(lián)的shRNAs,從而抑制了多個基因的表達(dá),其對應(yīng)蛋白的表達(dá)都有明顯降低。但有研究提出siRNA可誘導(dǎo)IFN反應(yīng),從而存在一些安全性問題。相對于siRNA,由polⅡ啟動子介導(dǎo)的amiRNA技術(shù)被證實(shí)不會引起宿主的免疫反應(yīng),亦沒對miRNA的內(nèi)源性途徑產(chǎn)生影響,安全有效。有研究采用該種方法將

5、2個串聯(lián)序列amiRNA導(dǎo)入細(xì)胞,但未取得更好的干擾效果,可能是因?yàn)椴]有找到最佳的干擾序列。另外,關(guān)于串聯(lián)序列amiRNA在HBV DNA水平的干擾效果,尤其是cccDNA方面的干擾效率未見報道。HBV是一個DNA病毒,但必須經(jīng)過前基因組RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,使得RNA干擾得以發(fā)揮作用,臨床中HBV DNA的檢測更為實(shí)用。cccDNA是HBV的源泉,使得對它的觀察更為重要。因?yàn)槠浒胨テ谳^長,所以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染更能接近臨床研究情況。
　　

6、 目的:本文結(jié)合以往研究的經(jīng)驗(yàn),針對HBV容易變異的特點(diǎn),力圖尋找針對HBV基因組保守區(qū)域的多個有效干擾位點(diǎn);將構(gòu)建的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染入HepG2.2.15,檢測各個序列在RNA水平對HBV的干擾效率:挑選干擾效果好的序列,優(yōu)化設(shè)計并構(gòu)建針對不同位點(diǎn)的串聯(lián)序列amiRNA表達(dá)載體;通過瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定篩選,全面研究單一序列及串聯(lián)序列amiRNA表達(dá)載體在抑制HBV RNA、DNA和蛋白質(zhì)表達(dá)及cccDNA方面的效果。
　　 方法:

7、r>　　 1.針對病毒容易變異而逃逸RNAi作用的特點(diǎn),我們首先利用生物信息學(xué)軟件找到不同基因型HBV基因的保守區(qū)域,避開臨床常見的病毒變異位點(diǎn)選取4個HBV的RNAi靶位點(diǎn),分別靶向HBV的S區(qū)或X區(qū)。
　　 2.利用microRNA設(shè)計軟件,設(shè)計4條microRNA序列,并構(gòu)建四個以CMV為啟動子的內(nèi)源性miR155為骨架的amiRNA表達(dá)質(zhì)粒,分別命名為amiHBV-1、amiHBV-2、amiHBV-3和amiHBV-

8、4。
　　 3.將構(gòu)建成功的4個amiHBV表達(dá)載體分別瞬時轉(zhuǎn)染到含有HBV-DNA全基因的人肝母細(xì)胞瘤HepG2.2.15細(xì)胞株,從mRNA水平研究單一序列amiHBV對HBV mRNA干擾效果,篩選干擾效率高的amiRNA序列,將其中2條干擾效率較高的單一序列串聯(lián),構(gòu)建串聯(lián)序列amiRNA表達(dá)質(zhì)粒(amiHBV-3-4)。
　　 4.將串聯(lián)序列amiHBV表達(dá)質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染入HepG2.2.15細(xì)胞,因?yàn)閍mi-HBV

9、1和ami-HBV2在HBV mRNA水平的抑制效率低,在下一步的實(shí)驗(yàn)中將其舍去。采用實(shí)時定量熒光PCR法分別檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞內(nèi)的HBV DNA;采用CMIA法(Chemiluminescent Microparticle Inmaunoassay)定量檢測分泌蛋白HBsAg和HBeAg的水平變化。
　　 5.通過轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選,建立amiRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15細(xì)胞株,采用熒光實(shí)時定量檢測試劑盒,對

10、amiRNA干擾HBV的復(fù)制根源cccDNA的效果進(jìn)行了研究。
　　 結(jié)果
　　 1.本研究中4個不同靶位的amiRNA載體被構(gòu)建,4個單一序列及1條串聯(lián)序列amiHBV表達(dá)載體均經(jīng)測序驗(yàn)證構(gòu)建成功。
　　 2.4個單一序列amiHBV表達(dá)質(zhì)粒以amiHBV-4對HBV mRNA的抑制率最高可達(dá)75.6％,amiHBV-3對HBV mRNA的抑制率為61.2%;而amiHBv-1和amiHBV-2對HBVmRNA

11、的抑制率僅為29.3%及14.9%:其中串聯(lián)序列amiHBV3-4的干擾效率為87.2%,串聯(lián)序列組的干擾效率高于單一序列組。
　　 3.各組質(zhì)粒對培養(yǎng)細(xì)胞上清中HBV DNA的干擾效率以串聯(lián)序列質(zhì)粒組最高可達(dá)到94.3%,單一序列組中干擾效率最高的分別為amiHBV-3組60.5%和amiHBV-4組68.0%。對細(xì)胞內(nèi)HBV DNA的干擾效率amiHBV-3組、amiHBV-4組和amiHBV3-4組分別為71.6%、80.

12、2%和79.7%。
　　 4.在轉(zhuǎn)染后72h對細(xì)胞上清中HBsAg的抑制效果最好的為串聯(lián)序列組達(dá)到67.4%,其次為amiHBV-4組達(dá)到64.6%，再次為amiHBV-3組。對HBeAg的抑制總體效果不及對HBsAg的抑制效果好,串聯(lián)序列組抑制效果最好,但也只達(dá)到了31%。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后兩組(amiHBV3-4和amiHBV-4)對HBsAg和HBeAg的分泌,均顯示了顯著的抑制效果。對HBsAg的抑制率最高達(dá)97.18%,對HB

13、eAg的抑制率最高達(dá)97.00%。
　　 5.對HBV cccDNA的干擾情況進(jìn)行了研究,瞬時轉(zhuǎn)染amiHBV-4組對HBV cccDNA的抑制率為21.9%,串聯(lián)序列amiHBV3-4組的抑制率(58.4%)明顯高于單一序列組。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后串聯(lián)序列組HBV cccDNA的抑制率為99.65%,單一序列組的抑制率為93.78%。
　　 結(jié)論:
　　 1.分別靶向HBV S區(qū)基因256-276bp和672-692bp

14、位點(diǎn)的單一序列amiRNA對HBVRNA、DNA和表面抗原(HBsAg)均有顯著的干擾效果。
　　 2.同時靶向HBV S區(qū)基因256-276bp和672-692bp兩個位點(diǎn)的串聯(lián)序列amiRNA對HBV RNA、DNA和HBsAg的干擾效果均顯著優(yōu)于單一序列HBVamiRNA的干擾效果。
　　 3.瞬時轉(zhuǎn)染靶向HBV S區(qū)的串聯(lián)序列amiRNA對HBsAg的抑制效果顯著,對HBeAg的抑制不明顯;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染串聯(lián)序列ami

15、RNA對HBsAg和HBeAg均有顯著的抑制效果。
　　 4.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單一序列或串聯(lián)序列amiRNA對HBV DNA、cccDNA、HBsAg及HBeAg的抑制效果均優(yōu)于瞬時轉(zhuǎn)染的抑制效果。
　　 5.針對HBV S區(qū)基因的單一序列或串聯(lián)序列amiRNA對HBV RNA、表面抗原(HBsAg)、DNA及cccDNA均有較好的干擾效果,提示HBV S區(qū)基因是RNA干擾的有效靶點(diǎn)之一。
　　 6.串聯(lián)序列amiRN