利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)清除乙肝病毒(HBV)感染的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染會引起慢性肝炎、肝硬化及細(xì)胞癌等肝臟疾病，全球每年約有100萬人死于乙肝病毒感染引起的肝臟疾病。雖然乙肝疫苗的廣泛應(yīng)用在很大程度上預(yù)防了乙肝病毒的傳播，然而慢性乙肝的治療一直處于困境。目前公認(rèn)有效的治療藥物主要為核苷酸類似物，但核苷酸類似物僅能暫時(shí)降低患者血清中的病毒載量，甚至有停藥后再度暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。這主要是因?yàn)槟壳芭R床上的治療方法均不能清除乙肝慢性感染和復(fù)發(fā)的根源，也就是肝

2、細(xì)胞內(nèi)乙肝病毒的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）和HBV在復(fù)制過程中整合至宿主細(xì)胞基因組上的整合狀態(tài)HBV DNA。因此，探尋從根本上清除HBV的方法成為治療慢性乙肝的當(dāng)務(wù)之急。
　　近年來基于細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)CRISPR開發(fā)出的CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)幾乎可以對任何物種進(jìn)行DNA的精確編輯，這一方便、快捷的技術(shù)使得從根本上清除HBV cccDNA和整合狀態(tài)的HBV DNA成為了可能。在本研究中，我們首先利用CRIS

3、PR-Cas9基因編輯技術(shù)在HBV細(xì)胞模型以及HBV小鼠模型中實(shí)現(xiàn)了對乙肝病毒復(fù)制根源HBV cccDNA的靶向剪切以及對乙肝病毒復(fù)制與表達(dá)的高效抑制。隨后，我們又利用該技術(shù)在清除HBV cccDNA的同時(shí)，完全清除了HBV細(xì)胞模型中全長整合的HBV基因組，實(shí)現(xiàn)了對感染細(xì)胞中HBV更加徹底的清除。最后，為了檢測CRISPR-Cas9在清除HBV過程中對細(xì)胞基因組造成的影響，我們利用全基因組測序技術(shù)評估了感染及清除HBV前后宿主細(xì)胞基因組

4、的變化，并首次發(fā)現(xiàn)了宿主細(xì)胞基因組上有大量SNP會隨著HBV的清除而恢復(fù)至HBV感染前的類型。
　　1.CRISPR-Cas9抑制HBV復(fù)制與表達(dá)的研究
　　（1）剪切HBV DNA的高效gRNA靶點(diǎn)篩選
　　由于HBV基因組變異位點(diǎn)較多，開放閱讀框高度重疊，且宿主細(xì)胞中存在多種形式的HBV DNA，為了篩選出能夠高效剪切HBV基因組的gRNA靶點(diǎn)，我們通過生物信息學(xué)比對以及對CRISPR-Cas9剪切活性的檢測，從8

5、個(gè)候選gRNA中篩選出了對HBV DNA剪切及抑制效率最高的gRNA-S4靶點(diǎn)。通過深度測序，我們證實(shí)了該系統(tǒng)對HBV基因組的剪切作用并評估了該系統(tǒng)的剪切效率。
　?。?）利用gRNA-S4系統(tǒng)高效抑制細(xì)胞及小鼠體內(nèi)HBV的復(fù)制與表達(dá)
　　我們利用HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系HepG2.A64以及HBV高壓水動力小鼠分別作為模型，分別檢測了gRNA-S4在體內(nèi)、外對HBV復(fù)制的抑制效果。結(jié)果顯示，gRNA-S4在細(xì)胞中高效抑制了HBV復(fù)

6、制與表達(dá)并將HBV cccDNA含量降低了95.37±0.64％。我們還利用該系統(tǒng)將HBV高壓水動力小鼠血清中的HBsAg含量降低了99.92±0.04%，將小鼠血清中的HBV DNA降至了陰性臨界值以下。
　?。?）CRISPR-Cas9靶向HBV的特點(diǎn)分析
　　在上述實(shí)驗(yàn)中，由于細(xì)胞中存在多種形式的HBV DNA，其中環(huán)狀HBV DNA在CRISPR-Cas9剪切后即降解。因此，我們在研究中發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas9對細(xì)

7、胞中HBV的剪切效率實(shí)際上要遠(yuǎn)低于對HBV表達(dá)的抑制效率。此外，由于HBV基因組編碼區(qū)的高度重疊，我們僅用破壞一個(gè)位點(diǎn)便可抑制HBV全部基因的表達(dá)。
　　2.CRISPR-Cas9清除整合狀態(tài)HBV DNA的研究
　　HBV在感染過程中會將病毒基因組整合到宿主細(xì)胞染色體上，而這些整合的HBV DNA被認(rèn)為是肝細(xì)胞癌發(fā)生的重要因素，會引起宿主基因組的變異進(jìn)而改變細(xì)胞增殖與分化相關(guān)基因的表達(dá)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室常用的HBV轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模

8、型中除了含有HBV cccDNA均整合有HBV的全長基因組，且全長整合的HBV DNA是穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型中HBV復(fù)制與表達(dá)的主要模板。因此，為了實(shí)現(xiàn)對HBV感染的清除，除了靶向降解HBV cccDNA之外，我們還必須清除細(xì)胞染色體上全長整合的HBV DNA。由于HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中的乙肝病毒生活周期及復(fù)制模式與實(shí)際情況類似，均存在HBV cccDNA和HBV復(fù)制中間體等多種形式的HBV DNA。因此利用CRISPR-Cas9在 HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模

9、型中清除全長整合的HBV DNA同樣能夠很好地模擬真實(shí)感染中清除HBV DNA整合片段的過程。
　?。?）建立了特異性擴(kuò)增HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中全長整合HBV DNA的新方法
　　由于HBV細(xì)胞模型中HBV整合位點(diǎn)較多，且細(xì)胞內(nèi)存在多種形式的HBV DNA，利用Alu-PCR以及細(xì)胞全基因組測序均難以定位出全長整合HBV基因組的具體位置。在本部分實(shí)驗(yàn)中，我們建立了一種特異性擴(kuò)增HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型中全長整合HBV基因組的新方法，即利

10、用HBV全長整合位點(diǎn)3’端外源啟動子特異性引物，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞基因組中全長整合HBV基因組的擴(kuò)增。
　　（2）首次清除HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中全長整合的HBV DNA
　　我們利用靶向全長整合HBV基因組兩端側(cè)翼序列的gRNA-69系統(tǒng)成功清除了細(xì)胞中全長整合的HBV基因組。在清除細(xì)胞中全長整合的HBV DNA后，細(xì)胞中的HBV cccDNA、HBsAg、HBeAg、HBV DNA在連續(xù)300天的培養(yǎng)中均無法檢出。這部分結(jié)果表明，我們首

11、次利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)清除了細(xì)胞內(nèi)的HBV感染。
　　3.清除HBV前后宿主細(xì)胞全基因組測序及分析
　?。?）清除HBV感染后細(xì)胞基因組中HBV整合位點(diǎn)大量消失
　　為了探究CRISPR-Cas9在清除HBV的過程中對宿主細(xì)胞基因組可能造成的影響，我們對HBV清除前后的細(xì)胞株以及HBV整合前的HepG2細(xì)胞株分別進(jìn)行了全基因組測序。通過對3株細(xì)胞HBV整合位點(diǎn)的分析，我們發(fā)現(xiàn)相比清除HBV前的細(xì)胞HepG2.

12、A64，清除了HBV后的69-7細(xì)胞基因組中HBV的隨機(jī)整合位點(diǎn)減少了97.7%。
　?。?）清除HBV感染后細(xì)胞基因組中大量SNP恢復(fù)至HBV感染前狀態(tài)
　　通過對HBV感染及清除前后3個(gè)細(xì)胞基因組上突變尤其是SNP的分析，我們發(fā)現(xiàn)，HBV感染后的A64細(xì)胞中共有2,284,202個(gè)SNP位點(diǎn)發(fā)生了變異，而其中的2,093,238的SNP位點(diǎn)在HBV被清除后恢復(fù)成了HBV感染前的狀態(tài)。
　?。?）排除CRISPR-C

13、as9脫靶效應(yīng)及細(xì)胞污染的可能性
　　為了進(jìn)一步探究清除HBV感染后宿主細(xì)胞基因組突變恢復(fù)的原因，我們首先利用同源序列分析了gRNA的脫靶效應(yīng)，證實(shí)了gRNA-69不存在明顯的脫靶效應(yīng)。然后通過對HBV整合位點(diǎn)的分析，證實(shí)了清除HBV后的69-7細(xì)胞并非此前HBV感染細(xì)胞A64中污染的HepG2細(xì)胞。最后通過對gRNA-69剪切后的殘余序列進(jìn)一步分析，證實(shí)了清除HBV后的69-7細(xì)胞并非gRNA-69轉(zhuǎn)染之前存在于A64細(xì)胞中的亞

14、克隆，而是gRNA-69剪切A64細(xì)胞中HBV后所形成的細(xì)胞克隆。這部分結(jié)果否定了細(xì)胞基因組突變的恢復(fù)與CRISPR-Cas9的脫靶及細(xì)胞污染有關(guān)。
　?。?）清除HBV感染后細(xì)胞基因組突變恢復(fù)的原因分析
　　通過對HBV感染及清除前后細(xì)胞基因組SNP類型變化情況的分析結(jié)果以及宿主細(xì)胞DNA修復(fù)通路中RAD51基因表達(dá)量的檢測結(jié)果我們推測，這種雜合SNP的恢復(fù)或許是由于存在同源修復(fù)模板，進(jìn)而在DNA修復(fù)系統(tǒng)的參與下實(shí)現(xiàn)的恢復(fù)

15、。
　　本次研究中，我們利用CRISPR-Cas9技術(shù)首次實(shí)現(xiàn)了對宿主細(xì)胞內(nèi)乙肝病毒感染的清除，深入分析了CRISPR-Cas9在清除HBV過程中的脫靶效應(yīng)、抑制效率以及作用時(shí)間。在清除了HBV感染后的細(xì)胞基因組中，我們還觀察到了大量HBV的整合位點(diǎn)以及宿主細(xì)胞基因組變異會隨著HBV的清除而恢復(fù)。本次研究展現(xiàn)了CRISPR-Cas9技術(shù)在根治慢性乙肝以及阻斷其向肝細(xì)胞癌發(fā)展方面的巨大潛力。此外，清除HBV感染后宿主細(xì)胞基因組上的新