CRISPR-Cas9基因敲除技術(shù)在家蠶基因功能研究中的應(yīng)用.pdf

1、家蠶是重要的吐絲營繭昆蟲，也是生物研究的模式昆蟲之一。CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)是近兩年發(fā)展起來的一種來源于細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)，經(jīng)過人工的改造，目前已被廣泛運(yùn)用于多種模式生物的研究，成為一種強(qiáng)大的研究工具。本研究分別選擇了家蠶體壁等顏色相關(guān)和絲腺發(fā)育相關(guān)的兩類基因，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除基因后獲得突變體，成功建立了一套高效快速的家蠶基因敲除技術(shù)體系，為家蠶功能基因組學(xué)的研究提供了一個有力的工具。同時，對

2、敲除了絲腺相關(guān)基因的家蠶個體進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序RNA-seq，初步闡釋了家蠶絲腺發(fā)育的分子機(jī)制。主要結(jié)果如下:
　　1.運(yùn)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功敲除了家蠶4個與體壁等透明性及顏色相關(guān)的基因Bm-ok、BmKMO、BmTH、Bmtan。根據(jù)靶點(diǎn)設(shè)計原則，對這4個基因共設(shè)計了8個靶點(diǎn)，其中BmTH3個，Bm-ok、Bmtan各2個，BmKMO僅1個靶點(diǎn)。將體外合成的高質(zhì)量的Cas9-mRNA和sgRNA混合后顯微注射到家蠶剛產(chǎn)

3、的卵內(nèi)，結(jié)果表明這8個靶點(diǎn)的sgRNA均發(fā)揮了敲除效應(yīng)，敲除的突變率大概為16.7％-35.0％，但不同基因不同靶點(diǎn)的突變率不同，如Bmtan2個靶點(diǎn)，突變率僅16.7％。由于Cas9蛋白切割DNA后突變是隨機(jī)發(fā)生的，所以4個基因的突變類型多種多樣，刪除和插入(indel)的堿基數(shù)目不可預(yù)測，同時注射一個基因的多個sgRNA，可能僅在1個靶點(diǎn)處發(fā)生突變，也可能多個靶點(diǎn)同時發(fā)生突變，從而發(fā)生大片段的刪除。但是1個靶點(diǎn)也會發(fā)生大片段的刪除，

4、如BmKMO在靶點(diǎn)處刪除了240 bp和289 bp長的片段。通常CRISPR/Cas9存在發(fā)生脫靶效應(yīng)的可能，從而對個體造成危害。但本實驗檢測結(jié)果并無明顯的脫靶發(fā)生，所以該CRISPR/Cas9系統(tǒng)用于基因敲除特異性高。本研究成功得到了Bm-ok突變體，其G0代表現(xiàn)為嵌合體表型，表皮成塊狀透明，而G1代純合體表皮即完全透明，似“油蠶”。
　　2.運(yùn)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功敲除了與家蠶絲腺發(fā)育相關(guān)的基因Bmsage。針對B

5、msage基因的結(jié)構(gòu)設(shè)計了1個靶點(diǎn)，敲除的突變率約為46.7％，高于4個體壁相關(guān)基因的突變率。隨機(jī)選擇了7個與靶點(diǎn)相似度最高的脫靶靶點(diǎn)，檢測了Bmsage靶點(diǎn)的脫靶效應(yīng)，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有明顯的脫靶發(fā)生。通過測序篩選出了Bmsage純合突變體，并從G2代中篩選出了其不同于野生型的突變表型，即絲腺發(fā)育畸形，僅保留了完整的ASG和一小段MSG，而缺失了PSG。該突變體熟蠶失去了吐絲的本能，存活下來的突變體最終形成了完全的裸蛹，但可以正?；?、交配

6、和產(chǎn)卵。部分突變體會在化蛹期間死亡，或保持幼蟲蟲態(tài)或形成畸形的蛹。同時還解剖了蟻蠶的絲腺，發(fā)現(xiàn)其表型與五齡期一樣，并分離出兩種不同基因型但表型一致的突變體，也均缺失中后部絲腺，從而確認(rèn)了Bmsage突變體的絲腺缺失表型是Bmsage基因敲除的結(jié)果，因此Bmsage可能參與了家蠶胚胎期絲腺的生成和發(fā)育。
　　3.對敲除后的G0代嵌合體，通過交配策略1（G0代mosaic×WT）可以用來評估突變的germline概率，Bm-ok的ge

7、rmline概率約為28.6％，而Bmsage的germline概率約為75％，可見該CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)具有很高的突變遺傳概率，足以從G1代中篩選出純合突變體。通過交配策略2（G0代mosaic×mosaic），可以快速獲得純合突變體，縮短篩選時間，Bm-ok G0代突變體交配后，G1代中高達(dá)90％以上的個體均表現(xiàn)為透明表皮，但得到的純合突變體的基因型不一定相同，兩條染色體上的等位基因可能有差異，所以得到的是復(fù)合型雜合子

8、。
　　4.對Bmsage絲腺缺失型突變體的RNA-seq結(jié)果分析，初步了解了Bmsage可能參與的生理生化過程。GO結(jié)果顯示Bmsage基因功能缺失后，對家蠶生理功能的影響主要集中在一些細(xì)胞組分，如與肌肉功能相關(guān)的肌球蛋白和肌鈣蛋白基因都表現(xiàn)出明顯的上調(diào)，碳水化合物代謝相關(guān)的基因如多種凝集素基因和糖苷酶基因，除個別下調(diào)外，其他也均上調(diào)。而排在前10的GO中，出現(xiàn)較多的是與幾丁質(zhì)分解代謝相關(guān)的幾丁質(zhì)酶基因和多種絲氨酸蛋白酶抑制劑基

9、因。KEGG分析顯示Bmsage基因主要與一些糖類、脂類和氨基酸的代謝的信號通路相關(guān)，其中又以糖類代謝為主，如半乳糖代謝、糖胺聚糖降解及氨基糖和核苷酸糖代謝，所以Bmsage可能參與了多個糖類代謝途徑。在差異基因中與絲腺發(fā)育相關(guān)性最大的是幾丁質(zhì)酶基因、β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因和絲氨酸蛋白酶抑制劑基因，以及一些轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因，如TRNAE-CUC、TRNAN-G UU、TRNAD-GUC和TRNA V-GAC。因此Bmsage可能通過