CRISPr-Cas9技術(shù)介導(dǎo)阿爾巴斯白絨山羊MSTN基因敲除的研究.pdf

1、肌肉生長抑制素(Myostatin，MSTN)又稱生長分化因子-8(growthdifferentiation factor8，GDF-8)，是一類重要的骨骼肌細(xì)胞生長發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子，研究表明，該基因的缺失、突變能加速肌肉生長和改變紅白肌的組成比例并增加肌肉量。CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種來源于細(xì)菌獲得性免疫的由RNA指導(dǎo)Cas蛋白對靶向基因進行修飾的技術(shù)。本研究利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對阿爾巴斯白絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞和肌肉衛(wèi)

2、星細(xì)胞中的MSTN基因進行了敲除，并通過實時定量PCR與Western blot檢測了MSTN基因敲除后成纖維細(xì)胞中與之相關(guān)基因的表達情況，為通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)生產(chǎn)基因編輯動物奠定基礎(chǔ)。
　　1、gRNA表達載體的設(shè)計、構(gòu)建與轉(zhuǎn)染效率分析
　　本實驗通過麻省理工學(xué)院的CRISPR Design（http://crispr.Mit.edu）軟件設(shè)計4對長20nt的gRNA，以gRNA-T2為模板進行PCR，擴增得到

3、完整的gRNA（最終PCR產(chǎn)物長度為455bp）。
　　為了篩選適應(yīng)于山羊細(xì)胞的最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件，本研究利用電穿孔法將紅色熒光蛋白表達載體pCMV-DsRed導(dǎo)入絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中，通過流式細(xì)胞儀進行分析的結(jié)果表明，最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件為:每1×106個絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞加入pCMV-DsRed質(zhì)粒10μg(1μg/μL)，Opti-MEM90μL，電壓225V，脈沖時間2.5ms。
　　利用以上最佳轉(zhuǎn)染條件將hCas9載體和gR

4、NA共同導(dǎo)入阿爾巴斯絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中，培養(yǎng)48h后提取基因組，設(shè)計跨打靶位點的PCR引物進行PCR擴增，使用Surveyor突變檢測試劑盒進行檢測，確定有3個gRNA敲除效率較高，可以進行下一步實驗。
　　2、利用CRISPR-Cas9技術(shù)制備MSTN基因敲除絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞和肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的的制備與分析
　　采用最適合的轉(zhuǎn)染條件，將hCas9載體和gRNA導(dǎo)入阿爾巴斯絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中和肌肉衛(wèi)星細(xì)胞中，隨機挑取

5、單個細(xì)胞培養(yǎng)，建立單克隆細(xì)胞系。對每個單克隆細(xì)胞系的基因組進行PCR擴增并進行測序，篩選出靶位點發(fā)生突變的單克隆細(xì)胞系。本研究共獲得62個胎兒成纖維單克隆細(xì)胞系，其中有10個單等位基因敲除的單克隆細(xì)胞系和10個雙等位基因敲除的單克隆細(xì)胞系，總敲除效率為32.25％。還獲得了6個肌肉衛(wèi)星單克隆細(xì)胞系，其中有5個雙等位基因敲除的陽性單克隆細(xì)胞系，總敲除效率為83.33％。
　　本研究選取了雙等位基因敲除的陽性成纖維細(xì)胞細(xì)胞系C205，