CRISPR-Cas9介導MSTN基因敲除綿羊制備.pdf

1、肌肉性狀是動物的重要經(jīng)濟性狀之一，肌肉生長過程受遺傳和環(huán)境雙重因素影響，研究表明肌肉的發(fā)生和發(fā)育過程涉及到諸多基因的調(diào)控作用，其中肌肉生成抑制素(Myostatin，MSTN)基因被認為是與動物酮體重和瘦肉率有關的主要基因。MSTN基因，又名GDF-8(growth differentiation factor8)，屬于TGF-β（transforming growth factorβ，轉化生長因子β）超家族GDF亞族，高度表達于動物機

2、體骨骼肌中，是負向調(diào)控肌肉生長的重要基因，許多科學研究都表明該基因表達水平與肌肉重量的變化呈負相關，或突變可以造成肌肉過度肥大。本研究利用CRISPR/Cas9技術敲除MSTN基因，驗證其對于肌細胞分化的影響作用，并利用單克隆細胞系篩選和體細胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)技術制備MSTN基因缺失表達的轉基因綿羊個體，研究結果為改善綿羊肌肉品質(zhì)和經(jīng)濟效益提供參考價值，對于培育新型肉用綿羊品

3、種和豐富生物多樣性也具有理論和實踐意義。主要研究內(nèi)容和結果如下:
　　1.MSTN基因敲除載體構建及活性驗證:以綿羊肌肉組織總RNA反轉錄獲得的cDNA為模板，PCR體外擴增綿羊MSTN基因CDS序列，產(chǎn)物純化后送公司測序分析;設計在全基因組內(nèi)無同源性的靶位點gRNA，體外搭橋PCR構建包含gRNA酶切DNA，以已知SSA活性的標準gRNA為對照，Cas9酶切反應檢測luciferase信號;構建高體外活性的sMSTN-Cas9/

4、gRNA敲除載體，以FuGene HD脂質(zhì)體按1∶3的比例轉染自1周齡小羊耳組織真皮層分離的SEFs（sheep ear fabroblasts，綿羊耳成纖維細胞），陽性細胞收集并提取基因組DNA，克隆出靶點前后1000bp左右片段，T7E1酶切檢測靶點活性。測序結果顯示MSTN基因克隆成功，與綿羊同源性為100％;體外活性共驗證4個gRNA靶點，酶切活性分別50％、65％、5％、95％;選取最高的gRNA4靶點進行內(nèi)源活性驗證，結果表

5、明突變型基因組成功被T7E1酶剪切出相應大小的條帶，顯示該靶點具有兼具外源和內(nèi)源活性，符合后期實驗要求。
　　2.MSTN基因敲除影響SMSCs成肌分化的研究:采用兩酶消化法分離sSMSC(SheepSkeletal muscle Satellite Cell，sSMSC)，采集剛出生小羊骨骼肌，經(jīng)肌膜剝除、肌絲消化和差速貼壁純化等步驟，在F5代獲得了較高純度的sSMSCs。間接免疫熒光檢測sSMSCs標記基因Pax-7并統(tǒng)計陽性

6、細胞，結果為89.3％士2.8％的細胞為Pax-7陽性細胞，表明sSMSCs純度較高;1％低血請濃度饑餓誘導sSMSCs顯示在72h可以得到大量分化早期的肌管細胞。將MSTN-Cas9/gRNA4載體轉染sSMSCs，puro連續(xù)篩選后饑餓誘導72h，間接免疫熒光檢測成肌分化早期標志Desmin蛋白，結果顯示:1％低濃度血清饑餓誘導處理72h，對照組和敲除組肌管形成效率分別為11.2±1.3％、19.5±2.1％，肌管平均長度為22±3

7、.4μm、47±2.8μm，顯示MSTN基因敲除可以在數(shù)量和長度上促進衛(wèi)星細胞成肌分化。
　　3.無標記敲除MSTN基因單克隆細胞系制備:為了符合轉基因動物生產(chǎn)規(guī)范和要求，對現(xiàn)有載體進行改造，利用限制性內(nèi)切酶MLuⅠ和SpeⅠ進行雙酶切反應切除包含標記基因GFP和puro片段，獲得無標記質(zhì)粒。以200V電壓轉染SEFs后利用細玻璃針和口吸管裝置，接種單個細胞至96孔板每小孔中使其貼壁生長并擴大成細胞系。以各單細胞系基因組DNA為模

8、板，PCR克隆靶點上下游片段，送公司測序。實驗接種4個96孔，一共觀察到107個小孔內(nèi)有細胞存在，其中93孔為單細胞，最終成功增殖的細胞系共61株;測序結果經(jīng)UCSC序列比對共得到3個突變型細胞系，突變率約為9.3％;其中18號細胞株靶點序列21bp正向缺失，15號細胞株發(fā)生29個堿基錯配，16號細胞株在靶點前11bp往后序列全部錯配。
　　4.SCNT法制備轉基因克隆綿羊:選擇突變堿基較多的16號為核移植供體細胞，體外分離綿羊卵

9、母細胞并成熟19-22h，挑選排第一極體的成熟卵母細胞為受體細胞。顯微鏡下去除受體細胞核并將供體細胞注入受體細胞膜與透明帶之間，電擊使兩者融合，融合胚胎經(jīng)孤雌激活和體外發(fā)育后，選擇均勻卵裂的胚胎手術移植入發(fā)情母羊排卵側卵巢連接的輸卵管內(nèi)。手術后3個月，利用B超檢測母羊妊娠情況。本次實驗中，綿羊卵母細胞體外成熟率、供受體融合率以及卵裂率平均值分別為66.0％、69.5％、80.9％，均達到了國內(nèi)平均水平;核移植手術共移植415枚胚胎至20