CRISPR-Cas9介導(dǎo)綠色熒光蛋白基因在牛KRT18位點(diǎn)定點(diǎn)整合的研究.pdf

1、角蛋白是一種外胚層結(jié)構(gòu)蛋白，是硬蛋白家族成員之一。據(jù)報(bào)道，角蛋白對(duì)生殖過(guò)程特別是對(duì)早期胚胎發(fā)育起著至關(guān)重要的作用，被作為滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞的標(biāo)記物。目前有關(guān)角蛋白的研究甚少，已知的角蛋白主要在表皮細(xì)胞以及簡(jiǎn)單上皮細(xì)胞中表達(dá)，具有高度的上皮細(xì)胞類型和組織分化的特異性。其中細(xì)胞角蛋白18(KRT18)屬于Ⅰ型(等電點(diǎn)為4.9-5.4)酸性角蛋白，不僅在穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)以及細(xì)胞的完整性與功能性方面有著重要的作用，而且在細(xì)胞周期、胞內(nèi)信號(hào)通路、細(xì)

2、胞凋亡、有絲分裂、早期胚胎著床等細(xì)胞內(nèi)生理過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用。
　　本研究針對(duì)牛角蛋白18(KRT18)基因設(shè)計(jì)并構(gòu)建了CRISPR/Cas9表達(dá)載體，稱為Cas9/gRNA。實(shí)驗(yàn)選用的質(zhì)粒載體具有新霉素抗性基因（Neor），通過(guò)對(duì)基礎(chǔ)框架載體進(jìn)行去除CAG啟動(dòng)子的改造（命名為pGlrkt-2）和KRT18基因5'及3'同源臂的插入，構(gòu)建了針對(duì)CRISPR/Cas9切割位點(diǎn)的同源打靶載體，并命名為pKlrkt.其外源基因?yàn)槿?/p>

3、源化的EGFP，在EGFP上游包含長(zhǎng)995bp的5'同源臂，在pKlrkt表達(dá)框架下游包含長(zhǎng)946bp的3'同源臂。經(jīng)限制性酶切片段分析及序列測(cè)定分析的結(jié)果表明，所構(gòu)建載體含有正確的KRT18同源片段和EGFP基因。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)入牛子宮上皮細(xì)胞中，可以觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，由此可確定，pKlrkt載體可指導(dǎo)GFP的正常表達(dá)。為了獲得GFP基因在KRT18基因位點(diǎn)定點(diǎn)整合的細(xì)胞系，通過(guò)電轉(zhuǎn)染的方法將CRISPR/