CRISPR-Cas9系統(tǒng)位點特異性研究及建立CRISPR-dCas9動物模型.pdf

1、自從認(rèn)識到基因組是生物遺傳信息的載體，科學(xué)家們便對通過改變基因、修飾基因進(jìn)而理解生物基因的功能產(chǎn)生了極大的興趣。一代又一代的科學(xué)家致力于基因編輯工具的開發(fā)與改進(jìn)，使其變得方便、準(zhǔn)確。基因編輯工具的研發(fā)極大地促進(jìn)了生物科學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)步。
　　規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)及其相關(guān)系統(tǒng)（CRISPR/Cas）原本是原核生物用來抵抗噬菌體病毒和外源質(zhì)粒等而存在的獲得性免疫系統(tǒng)。受其啟發(fā)，科學(xué)家們開發(fā)出的基因編輯與修飾工具CRISPR/Cas9，因

2、其簡單方便、易于操作，迅速在科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)得到推廣，并受到醫(yī)學(xué)界及商界人士的追捧，極力將其推廣到臨床，用以治療一些基因遺傳或突變引起的疾病。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)在基因編輯、基因表達(dá)調(diào)控、系統(tǒng)成像等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。然而，科學(xué)家在進(jìn)一步提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯效率的同時，也越來越多地關(guān)注到該系統(tǒng)的位點特異性研究。
　　本研究的前部分工作研究了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性。本研究采用染色質(zhì)免疫共沉淀和

3、二代高通量測序(ChIP-seq)的方法，研究了Cas9蛋白和特異靶向sgRNA在人類細(xì)胞基因組中的結(jié)合圖譜。本研究發(fā)現(xiàn)對于不同靶向RNA，Cas9蛋白在人類基因組中具有特異的結(jié)合脫靶效應(yīng)。針對這些脫靶效應(yīng)位點的進(jìn)一步生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，它們大部分都含有保守的與靶向RNA互補(bǔ)的10到12個堿基的種子序列(seed region)和3個堿基的PAM序列(protospacer adjacent motif)。然而令人驚訝的是，體內(nèi)和體外實

4、驗發(fā)現(xiàn)對于大部分的脫靶效應(yīng)位點（除了兩個位點外），Cas9雖然結(jié)合但并不切割這些脫靶位點。本研究還發(fā)現(xiàn)Cas9蛋白的結(jié)合脫靶效應(yīng)具有細(xì)胞特異性，提示染色質(zhì)構(gòu)象和其他可能的表觀遺傳因子參與了調(diào)控。本研究為進(jìn)一步解析CRISPR/Cas9基因組編輯的分子機(jī)制及優(yōu)化其在體內(nèi)和體外的應(yīng)用提供了重要的工具和方法。
　　本研究的后部分工作成功地構(gòu)建了各個組織器官中廣譜表達(dá)dCas9（缺失了酶切活性的Cas9）的SunTag-dCas9小鼠品系

5、。這項研究將用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)、表觀遺傳修飾、活體成像等CRISPR/dCas9系統(tǒng)，從細(xì)胞水平的研究擴(kuò)展到動物水平。SunTag-dCas9小鼠模型將為建立基因表達(dá)變化與疾病相關(guān)的動物模型，模擬疾病的發(fā)生、發(fā)展，對于人們理解疾病的發(fā)生機(jī)理提供極大的幫助。SunTag-dCas9小鼠模型的建立也將為CRISPR/dCas9在動物活體成像領(lǐng)域內(nèi)的研究提供強(qiáng)有力的工具。本研究構(gòu)建的SunTag-dCas9小鼠將推動CRISPR/dCas9在這